邢少華，劉文麗，貢漢生，劉曄，都靈瑋，王飛，魯暢

(魯東大學(xué) 食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái)　264025)

細(xì)菌素是由細(xì)菌的基因組DNA編碼，由核糖體合成的一類蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，具有天然抗菌能力和易降解的特性[1,2]。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素通常可分為四大類：Ⅰ類為羊毛硫抗生素；Ⅱ類是小分子的熱穩(wěn)定肽，相對(duì)分子質(zhì)量小(<10 kDa)，Ⅱ類細(xì)菌素又可以分為Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc等6個(gè)亞組；Ⅲ類是熱敏感大分子蛋白(LHLP)，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用并不廣泛；第Ⅳ類是復(fù)合型的大分子復(fù)合物[3，4]。

細(xì)菌素作為一種天然的食品防腐劑在發(fā)達(dá)國(guó)家被廣泛使用。如nisin(乳鏈菌肽)早在20世紀(jì)50，60年代就已被歐洲多個(gè)國(guó)家允許作為食品防腐劑，1988年美國(guó)FDA允許其在再制乳酪中使用。盡管現(xiàn)在已經(jīng)有很多除nisin A以外的細(xì)菌素被陸續(xù)報(bào)道出來(lái)，但細(xì)菌素在食品行業(yè)的應(yīng)用依然十分匱乏。因此，為了開(kāi)發(fā)出具有應(yīng)用前景的細(xì)菌素產(chǎn)品，許多研究人員致力于篩選具有高效廣譜抑菌性的細(xì)菌素合成菌株[5，6]。

泡菜是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，乳酸菌是其中最主要的微生物菌群[7，8]。乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生多種天然抑菌物質(zhì)，可以有效抑制腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng)，其中乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[9]。本研究從自制蘿卜泡菜中篩選出1株具有抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌的廣譜抑菌性乳酸菌，并鑒定該菌為植物乳桿菌。通過(guò)對(duì)該植物乳桿菌代謝產(chǎn)物的抑菌性研究發(fā)現(xiàn)，其主要抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素，并對(duì)該細(xì)菌素的生產(chǎn)曲線、耐熱性、耐酸堿性等生理特性進(jìn)行了研究，以期為開(kāi)發(fā)新型食品級(jí)生物保鮮劑奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用泡菜為實(shí)驗(yàn)室自制蘿卜泡菜。

過(guò)氧化氫酶、α-胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶：美國(guó)Sigma公司；PCR Master Mix：立陶宛Thermo Scientific公司；其他試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2　實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基

抑菌用指示菌株包括5株革蘭氏陽(yáng)性菌：藤黃微球菌 ATCC13513、枯草芽孢桿菌 ATCC6633、蠟狀芽孢桿菌 ATCC27348、植物乳桿菌 ATCC8014、單增李斯特菌 ATCC19113；3株革蘭氏陰性菌：鼠傷寒沙門氏菌 ATCC14028、大腸桿菌 ATCC25922、副溶血性弧菌 ATCC27969。

乳酸菌選用MRS培養(yǎng)基，單增李斯特菌選用BHI培養(yǎng)基，副溶血性弧菌選用TSA培養(yǎng)基，其他指示菌選用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.3　儀器與設(shè)備

pB-10型pH計(jì)新銳儀表儀器有限公司；721G型分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒天根生化科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀杭州博日科技有限公司；DYY-10C型電泳儀北京市六一儀器廠。

1.4　方法

1.4.1乳酸菌的分離純化

采用平板稀釋法[10]，取實(shí)驗(yàn)室自制蘿卜泡菜5～10 g，加入9倍的無(wú)菌蒸餾水粉碎混勻，梯度稀釋至10-3～10-6濃度，平板涂布于含有0.5 g/dL CaCO3的MRS培養(yǎng)基上。30 ℃倒置培養(yǎng)48 h后觀察菌株生長(zhǎng)情況，選取有鈣圈生成的菌落，挑取不同形態(tài)的單菌落，在MRS平板上劃線培養(yǎng)3次，純化為單一菌落。

1.4.2乳酸菌的初步確定及形態(tài)學(xué)觀察

挑取純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察和過(guò)氧化氫酶接觸試驗(yàn)。革蘭氏染色呈陽(yáng)性且過(guò)氧化氫酶呈陰性的菌落初步判斷為乳酸菌。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢記錄乳酸菌的形態(tài)特征。

1.4.3菌液pH測(cè)定

將純化好的乳酸菌株培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，用pB-10型pH計(jì)測(cè)定菌液pH并記錄。

1.4.4乳酸菌的抑菌性測(cè)定

采用濾紙片-瓊脂擴(kuò)散法篩選具有抑菌活性的乳酸菌株[11]，指示菌分別選用革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，其中5株革蘭氏陽(yáng)性菌包括藤黃微球菌(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng))、枯草芽孢桿菌(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng))、蠟狀芽孢桿菌(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng))、植物乳桿菌(MRS培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng))和單增李斯特菌(BHI培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng))，3株革蘭氏陰性菌包括鼠傷寒沙門氏菌(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng))、大腸桿菌(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng))和副溶血性弧菌(TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng))。抑菌環(huán)直徑用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，抑菌環(huán)直徑為3～6 mm，6～10 mm，以上2個(gè)范圍分別用“+”、“++”表示其抑菌能力。

1.4.5PY5-7的生長(zhǎng)曲線及抑菌性曲線

采用分光光度法測(cè)量PY5-7的生長(zhǎng)曲線。將液體培養(yǎng)的PY5-7按照1%(V/V)的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)48 h，每間隔3 h采用分光光度計(jì)測(cè)定1次吸光度(OD600),以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，做圖得到PY5-7的生長(zhǎng)曲線。同時(shí)，每間隔3 h取樣1次，于4 ℃，6000×g條件下離心10 min，測(cè)定上清液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌性，以PY5-7在測(cè)定時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的最大抑菌環(huán)直徑作為基準(zhǔn)，將其抑菌率定為100%，其他時(shí)間上清液的相對(duì)抑菌率為其抑菌環(huán)直徑與最大抑菌環(huán)直徑對(duì)比的百分率。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)抑菌率為縱坐標(biāo)，做圖得到PY5-7的抑菌性-時(shí)間曲線。

1.4.6抑菌物質(zhì)的初步確定[12]

使用10 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)PY5-7的發(fā)酵上清液pH值至7.0，排除有機(jī)酸的干擾。加入過(guò)氧化氫酶，排除過(guò)氧化氫的干擾。將0.2 mg/mL的α-胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin)、鏈霉蛋白酶(Pronase)和胰蛋白酶(Trypsin)做如下處理后分別加入PY5-7發(fā)酵上清液中：α-胰凝乳蛋白酶加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液調(diào)pH值為8.0；鏈霉蛋白酶加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液調(diào)pH值為7.8；胰蛋白酶加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液調(diào)pH值為8.0。37 ℃培養(yǎng)2 h，分別觀察添加酶液前后發(fā)酵上清液抑菌情況的變化，以未經(jīng)蛋白酶處理的作為對(duì)照組。

1.4.7抑菌物質(zhì)耐熱性的測(cè)定

將PY5-7發(fā)酵上清液分別在溫度為70，80，90 ℃的水中恒溫水浴加熱0.5，1，2，3 h，冷卻至室溫后測(cè)定其抑菌活性，以常溫下產(chǎn)生的抑菌圈作為對(duì)照[13]。

1.4.8抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定[14]

取等量的PY5-7發(fā)酵上清液，分別用20%的HCl或1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至1.0～12.0，室溫處理24 h調(diào)pH至7.0，測(cè)定其抑菌活性。

1.4.9糖酵解實(shí)驗(yàn)

將PY5-7接種于MRS培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，收獲菌體并用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次。根據(jù)API 50CHL系統(tǒng)說(shuō)明書將鹽水菌懸液接種于試驗(yàn)條，30 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果并判讀反應(yīng)類型，將判讀結(jié)果輸入系統(tǒng)測(cè)定軟件API plus中，根據(jù)菌株可發(fā)酵糖反應(yīng)類型確定其種類歸屬。

1.4.1016S rDNA序列分析

將篩選的乳酸菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。使用細(xì)菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')擴(kuò)增[15]，PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化后測(cè)序，得到的PCR產(chǎn)物序列通過(guò)BLAST在GenBank中進(jìn)行同源性比較，并將其鑒定到種。

2　結(jié)果與分析

2.1　泡菜中的乳酸菌的篩選

從自制蘿卜泡菜中分離出7株產(chǎn)酸菌株，經(jīng)過(guò)革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫觸酶陰性及發(fā)酵產(chǎn)酸情況初步確定為乳酸菌株。通過(guò)革蘭氏鏡檢顯示5株菌為桿菌,占71.54%，這與發(fā)酵后期泡菜的酸度較高，具有耐酸性的桿菌往往比不耐酸的球菌數(shù)目要多有關(guān)。7株菌的24 h發(fā)酵液pH均在4.0～5.0之間，顯示良好的產(chǎn)酸性。

2.2　乳酸菌的抑菌性測(cè)定結(jié)果

從泡菜分離出的7株乳酸菌中篩選出1株具有廣譜抑菌性的菌株，命名為PY5-7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PY5-7對(duì)5株革蘭氏陽(yáng)性菌均具有抑菌性；對(duì)3株革蘭氏陰性菌也均具有抑菌性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　PY5-7的抑菌性結(jié)果Table 1 Antimicrobial activity of PY5-7

注：“+”代表陽(yáng)性，且抑菌環(huán)直徑在3～6 mm之間；“++”代表陽(yáng)性，且抑菌環(huán)直徑在6～10 mm之間。

2.3　PY5-7菌株的一般特性

PY5-7單一菌落外觀呈圓形，白色，中間顏色比周圍稍深，見(jiàn)圖1。菌株為革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性，菌發(fā)酵液pH值為4.07，產(chǎn)酸性良好，結(jié)果見(jiàn)表2。PY5-7菌株為桿狀菌，無(wú)鞭毛，不產(chǎn)芽孢，不運(yùn)動(dòng)，顯微圖片見(jiàn)圖2。

表2　PY5-7的生化特性Table 2 Biochemical characteristics of PY5-7

圖1 PY5-7菌落外觀圖Fig.1 The colony appearance of PY5-7

圖2　PY5-7的革蘭氏染色菌株形態(tài)特征Fig.2 The morphological characteristics of gram stain PY5-7

2.4　PY5-7的生長(zhǎng)曲線及抑菌性曲線

采用比濁法測(cè)量PY5-7的生長(zhǎng)曲線，測(cè)定600 nm外的OD值。每隔3 h取樣1次測(cè)定OD600值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD600為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖3。

圖3　PY5-7的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of PY5-7

由圖3可知，PY5-7在0～24 h增殖迅速，24 h后菌株生長(zhǎng)進(jìn)入停滯期 。

采用濾紙片-瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定PY5-7的抑菌性曲線。每隔3 h取樣1次測(cè)定抑菌環(huán)的直徑，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、相對(duì)抑菌率為縱坐標(biāo)，繪制抑菌性曲線，見(jiàn)圖4。

圖4　PY5-7的抑菌性曲線Fig.4 Antibacterial curve of PY5-7

由圖4可知，PY5-7的抑菌性在菌株生長(zhǎng)期逐漸升高，在發(fā)酵30 h時(shí)達(dá)到最大，略晚于菌數(shù)達(dá)到最大的時(shí)間，主要是由于細(xì)菌素屬于二次代謝產(chǎn)物[16]。

2.5　抑菌性物質(zhì)初步鑒定結(jié)果及蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將PY5-7發(fā)酵上清液pH值調(diào)至7.0，發(fā)現(xiàn)抑菌效果無(wú)明顯差別；將PY5-7發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后，抑菌效果也無(wú)明顯差別，從而排除了有機(jī)酸和過(guò)氧化氫的干擾。

確定抑菌活性物質(zhì)是否具有蛋白質(zhì)類的性質(zhì)是確定抑菌活性物質(zhì)是細(xì)菌素的關(guān)鍵。PY5-7發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)不同的蛋白酶處理后，產(chǎn)生的抑菌圈直徑有所不同，見(jiàn)表3。發(fā)酵上清液經(jīng)α-胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶和胰蛋白酶處理后，用α-胰凝乳蛋白酶處理的發(fā)酵上清液的抑菌性有一定程度的減小，用鏈霉蛋白酶處理的發(fā)酵上清液完全失去抑菌性，用胰蛋白酶處理的發(fā)酵上清液抑菌性與對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異，初步判定該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)，應(yīng)為細(xì)菌素。PY5-7所產(chǎn)細(xì)菌素經(jīng)不同蛋白酶處理后抑菌能力的改變有所不同，與不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同有關(guān)。

表3　不同蛋白酶處理后的抑菌圈直徑Table 3 The diameter of inhibition zone after treatment with different proteases

2.6　耐熱性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將PY5-7發(fā)酵上清液分別在70，80，90 ℃下處理0.5～3 h，結(jié)果見(jiàn)表4。在 70 ℃條件下處理0.5，1，2，3 h后，PY5-7發(fā)酵上清液的抑菌性分別保留96.7%，94.6%，77.1%和25.3%；在 80 ℃條件下處理0.5，1，2，3 h后，PY5-7發(fā)酵上清液的抑菌性分別保留90.3%，95.7%，42.6%，10.8%；在90 ℃條件下處理0.5，1，2 h后，PY5-7發(fā)酵上清液的抑菌性分別保留72.7%，31.9%和2.3%。結(jié)果表明：該乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素具有較強(qiáng)的耐熱性，用于一般食品的熱加工不會(huì)影響其抑菌效果。

表4　PY5-7細(xì)菌素的耐熱性結(jié)果Table 4 The heat resistance of bacteriocin produced by PY5-7

注：a表示抑菌性以常溫狀態(tài)產(chǎn)生的抑菌圈作對(duì)照。

2.7　抑菌物質(zhì)在不同pH條件下的活性

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，PY5-7發(fā)酵上清液在pH值2.0～9.0之間抑菌活性較穩(wěn)定，當(dāng)pH為1.0及大于10.0的情況下，抑菌活性消失，結(jié)果見(jiàn)表5。這與文獻(xiàn)中報(bào)道的乳酸菌細(xì)菌素的耐酸堿結(jié)果基本一致[17]。

表5　不同pH值的抑菌活性Table 5 Antimicrobial activity of different pH values

注：“+”表示有抑菌活性；“-”表示沒(méi)有抑菌活性。

2.8　糖酵解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)菌株P(guān)Y5-7進(jìn)行49種碳水化合物的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行判讀，結(jié)果表明PY5-7可以利用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、山梨醇、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉靈檸檬酸鐵、水楊苷、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-松三糖、D-棉子糖和D-土倫糖，經(jīng)API plus軟件分析鑒定，菌株P(guān)Y5-7與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)有99.9%的同源性。

2.9　16S rDNA菌株鑒定結(jié)果

16S rDNA測(cè)序結(jié)果表明：PY5-7菌株與L.plantarumJCM1149(T) 的同源性達(dá)到99%以上，確定該菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，將其命名為L(zhǎng)actobacillusplantarumPY5-7。

3　討論

泡菜因其特殊的風(fēng)味、酸脆的口感以及各種功能性倍受各國(guó)消費(fèi)者的青睞。研究表明：泡菜具有減肥、防止皮膚老化、預(yù)防動(dòng)脈硬化、抗病毒和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等多種保健和醫(yī)療功效[18，19]。

泡菜發(fā)酵是由多種微生物菌群共同作用的結(jié)果，乳酸菌是其中數(shù)量最多，也是對(duì)泡菜的品質(zhì)影響最大的最主要的微生物類群。乳酸菌能夠降解原料中的糖、蛋白質(zhì)等生物大分子，形成乳酸、氨基酸等物質(zhì)，從而提高泡菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[20]；同時(shí)，乳酸菌發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，可以有效抑制腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng)，從而提高泡菜的保藏性及安全性[21]。

近年來(lái)，許多研究者從泡菜中篩選出一批具有抑菌性的乳酸菌株，如明串珠菌(Leuconostoccitreum)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、Lactobacillusharbinensis、腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)等[22-24]，并已將許多具有抑菌性的乳酸菌株重新應(yīng)用于泡菜發(fā)酵，以提高泡菜的品質(zhì)[25,26]。

本研究從實(shí)驗(yàn)室自制的蘿卜泡菜中分離出7株乳酸菌，其中有1株對(duì)藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、植物乳桿菌和單增李斯特菌5株革蘭氏陽(yáng)性菌均具有抑菌性；對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌3株革蘭氏陰性菌也均具有抑菌性，命名為PY5-7。排除過(guò)氧化氫和有機(jī)酸的干擾，這類抑菌物質(zhì)對(duì)某些蛋白酶敏感，證明其為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，確定其為細(xì)菌素。PY5-7所產(chǎn)的細(xì)菌素耐熱性良好，可以在較高溫度下仍然具有抑菌活性。熱加工是食品加工中最常用的方法，將該細(xì)菌素用于食品加工過(guò)程中時(shí)，熱加工技術(shù)不會(huì)影響其抑菌效果。研究表明：多數(shù)小分子細(xì)菌素是帶正電荷的，其PI值在8～11之間，而且是兩性分子，具有親水性和疏水性，其表達(dá)活性的pH范圍為3～7之間，它們吸附在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌表面的能力具有pH依賴性[27]。PY5-7所產(chǎn)細(xì)菌素在pH值2.0～9.0之間具有穩(wěn)定的抑菌活性，耐酸堿性良好。

通過(guò)API 50CHL糖酵解鑒定以及16S rDNA分析鑒定該菌為植物乳桿菌，命名為L(zhǎng)actobacillusplantarumPY5-7。植物乳桿菌是分布最廣泛也是在食品中應(yīng)用最廣泛的乳酸菌種之一。植物乳桿菌可產(chǎn)生多種植物乳桿菌素，植物乳桿菌素因其廣譜抑菌性，且基因編碼較為清晰，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。

細(xì)菌素具有安全性、高效性，其添加不改變產(chǎn)品風(fēng)味，病原菌對(duì)其不易產(chǎn)生抗性，而且它可以有效抑制或殺死病原菌，對(duì)于人體很安全。篩選具有廣譜抑菌性的乳酸菌，將其直接應(yīng)用于發(fā)酵食品加工，或?qū)⑵洚a(chǎn)生的細(xì)菌素制成生物防腐劑在食品中應(yīng)用，從而代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)防腐劑的使用，可以大大減少環(huán)境污染，增加食品的安全性，具有非常深遠(yuǎn)的意義。

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