牛春林，葉曉蕓，艾 尼，王振華，熱依汗，姜國(guó)勇，高 雁，宋素琴，楚 敏

(1.新疆石油管理局造林減排作業(yè)區(qū)，新疆克拉瑪依　834000；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊　830091)

0　引 言

【研究意義】近10余年來(lái)，在國(guó)家實(shí)施西部大開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略和新疆產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整下，新疆特色林果種植飛速發(fā)展，林果業(yè)已成為新疆農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要手段[1,2]。但隨著種植面積的增加，加之田間日常管理和水肥管理的不足，以及近年來(lái)氣候因素等，果樹(shù)腐爛病發(fā)病嚴(yán)重，已造成果樹(shù)枯死，果園減產(chǎn)，嚴(yán)重的造成毀園，制約了新疆特色林果業(yè)的發(fā)展[3]。因此，研究果樹(shù)的腐爛病病原及篩選相關(guān)生防菌劑對(duì)高效生物防治該病具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 果樹(shù)腐爛病又名爛皮病，主要危害枝干, 致使皮層腐爛壞死，常表現(xiàn)為潰瘍型和枝枯型兩種類(lèi)型。果樹(shù)腐爛病因其分布廣、難治愈、高復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，是果樹(shù)生產(chǎn)中重要的病害之一[4,5]。目前，新疆主要特色林果如蘋(píng)果、香梨、桃樹(shù)、核桃等果樹(shù)均有不同程度的發(fā)病[6-10]。研究表明，果樹(shù)腐爛病主要由殼囊孢菌Cytospora屬(有性型為蘋(píng)果黑腐皮殼菌Valsa屬)引起，我國(guó)目前已知相關(guān)病原菌共涉及該屬下6個(gè)種[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在現(xiàn)有報(bào)道中，新疆蘋(píng)果樹(shù)腐爛病致病菌有C.chrysosperma、C.mali、C.schulzeri和C.leucostoma引起，但存在著區(qū)域分布不迥，而有關(guān)李子樹(shù)腐爛病，此前國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。研究通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及分子生物學(xué)方法確定蘋(píng)果樹(shù)與李子樹(shù)病原菌的分類(lèi)地位；采用組織分離法和平板對(duì)峙法篩選得到拮抗效果較好的拮抗菌?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以新疆克拉瑪依綠城實(shí)業(yè)有限公司生態(tài)果園內(nèi)蘋(píng)果樹(shù)和李子樹(shù)腐爛病為研究對(duì)象，對(duì)其致病菌進(jìn)行分離鑒定，并開(kāi)展其相關(guān)拮抗菌的篩選，為新疆果樹(shù)腐爛病病原多樣性和開(kāi)展相關(guān)生物防治提供科學(xué)依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1腐爛病樣本

蘋(píng)果樹(shù)和李子樹(shù)腐爛病樣本采集自新疆克拉瑪依綠城實(shí)業(yè)有限公司生態(tài)果園內(nèi)。

1.1.2土樣采集

用于拮抗菌分離的土樣采集于生態(tài)果園內(nèi)果樹(shù)根部地下5～20 cm土壤。

1.1.3篩選培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，磷酸氫二鉀 3.0 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15 g/L，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

其它常見(jiàn)培養(yǎng)基：馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，高氏一號(hào)培養(yǎng)基(Gause' s No.1)。

1.2　方 法

1.2.1病原菌分離

取蘋(píng)果樹(shù)和李子樹(shù)腐爛病樣本枝條，在無(wú)菌工作臺(tái)中，先用75%的酒精消毒30 s，其次1.2% NaClO消毒3 min，然后用無(wú)菌蒸餾水清洗3次進(jìn)行表面消毒，放在無(wú)菌濾紙上晾干。 切取5 mm×5 mm左右具有典型腐爛病病征的組織塊，移至準(zhǔn)備好的PDA(含氯霉素)培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)，并觀(guān)察菌落長(zhǎng)出后挑取邊緣菌絲，進(jìn)行菌種純化和保藏[12]。

1.2.2拮抗菌分離

拮抗菌的分離采用雙層平板法進(jìn)行分離篩選。為了篩選快速生長(zhǎng)并產(chǎn)生拮抗作用的菌株，采用黑曲霉作為指示菌，孢子懸液控制在104～105CFU/mL，取0.2 mL均勻涂布于下層PDA培養(yǎng)基上，待懸液被培養(yǎng)基吸收后，倒入45℃左右的完全培養(yǎng)基或高氏培養(yǎng)基，待其凝固后備用[13,14]。

無(wú)菌條件下稱(chēng)取土樣5 g， 置于裝有50 mL 0.85 %生理鹽水三角瓶中(裝有無(wú)菌玻璃珠)，30℃ 條件下 120 r/min 振蕩 0.5 h，靜置。壤懸液經(jīng)梯度稀釋后，吸取0.2 mL涂布至上述平板上，于 30℃ 恒溫培養(yǎng)，并觀(guān)察菌落生長(zhǎng)和抑菌情況，挑選具有明顯抑菌圈，菌株菌落形態(tài)、大小及顏色不同菌落，進(jìn)行分離純化后，斜面4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3拮抗菌復(fù)篩

拮抗菌株的復(fù)篩采用平板對(duì)峙法進(jìn)行。以分離到的蘋(píng)果樹(shù)和李子樹(shù)腐爛病病原為指示菌。首先，將病原菌接種于PDA 平板進(jìn)行活化，30℃下培養(yǎng)至病原菌長(zhǎng)滿(mǎn)平板，用滅過(guò)菌的0.5 cm打孔器對(duì)病原菌打孔制成菌餅。然后，接種菌餅于PDA平板中心，采用四點(diǎn)對(duì)峙法將拮抗，每處理重復(fù)3次，并以未接拮抗菌的病原菌為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d后，觀(guān)察并測(cè)定抑菌效果[10,15]。

1.2.4菌株的分子生物學(xué)鑒定

病原真菌ITS 序列采用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’， ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進(jìn)行ITS序列PCR擴(kuò)增。細(xì)菌16S rDNA序列采用通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進(jìn)行16S rDNA 的PCR擴(kuò)增。

PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化回收后，送往北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)得序列人工校正后，真菌序列在http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/DefaultInfo.aspx數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，細(xì)菌序列在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，并分別調(diào)取同源性最高模式菌株及相關(guān)菌株序列, 使用MEGA5.0進(jìn)行CLUSTAL X多重比對(duì)，使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[16]，自舉值(Bootstrap) 為1 000。

2　結(jié)果與分析

2.1　腐爛病病原菌的分離與鑒定

2.1.1腐爛病原菌分離與純化

經(jīng)分離純化，分別從蘋(píng)果樹(shù)和李子樹(shù)腐爛病病害典型樣本中，分離得到真菌菌株5株，通過(guò)平板生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)學(xué)特征分析，初步確定菌株可分為兩類(lèi)，其中編號(hào)PF1、PF2、LF1為第一類(lèi)，菌絲生長(zhǎng)迅速，菌落初期為白色，羽毛狀擴(kuò)展，中間部位氣生菌絲明顯，棉絮狀，之后逐漸變?yōu)榛野咨＜s4 d長(zhǎng)滿(mǎn)平板。后期菌絲體逐漸變?yōu)榛野字梁诤稚⒎置诨液谏?圖1)；編號(hào)LF2、LF3為另一類(lèi)，菌絲生長(zhǎng)迅速，菌落初期為白色，羽毛狀擴(kuò)展，中間部位氣生菌絲明顯，棉絮狀，之后逐漸變?yōu)榛野咨＜s4 d長(zhǎng)滿(mǎn)平板。后期菌絲體逐漸變?yōu)榛野字梁诤稚⒎置诨液谏?圖2)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病僅涉及第一類(lèi)，而李子樹(shù)腐爛病兩類(lèi)均有發(fā)現(xiàn)。圖1，圖2

2.1.2病原菌分子鑒定

所得菌株分別利用真菌ITS 序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為600 bp 的PCR產(chǎn)物，通過(guò)進(jìn)一步序列測(cè)定和校正后，分別在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)及http://www.westerdijkinstitute.nl/ Collections/DefaultInfo.aspx數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)在線(xiàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所得菌株均與Valsa屬。進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建表明，菌株P(guān)F1、PF2、LF1與ValsamaliTY121同源性為100%；菌株LF2和LF3與ValsaleucostomaBJFU SXLM1064同源性為100%，初步確定研究所得腐爛病病原菌為Valsamali和Valsaleucostoma，其中蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病原菌僅為Valsamali，而李子樹(shù)腐爛病病原菌兩者均有。圖3

圖1PF1,PF2,LF1菌落形態(tài)
Fig.1Colony morphology of PF1,PF2 and LF1

圖2LF2,LF3菌落形態(tài)
Fig.2Colony morphology of LF2 and LF3

圖3基于真菌ITS序列建立的病原菌NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
Fig.3NJphylogenetictreeofpathogenicfungibasedon16SrDNAsequence

2.2　拮抗菌的分離和鑒定

以黑曲霉為指示菌，采用雙層平板法，對(duì)采集的生態(tài)果園內(nèi)果林根部土壤開(kāi)展了拮抗菌的分離篩選。通過(guò)樣品稀釋涂布，菌種的分離，共獲的對(duì)黑曲霉具有拮抗作用的菌株15株，其中細(xì)菌10株，放線(xiàn)菌5株。

15株菌株16S rDNA序列經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，所得序列提交至 EzTaxon 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ezbiocloud.net/identify)進(jìn)行相似度比較，同時(shí)分別調(diào)取各菌株同源性最高模式菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。所得菌株分別歸屬于鏈霉屬、諾卡氏菌屬、類(lèi)芽孢菌屬及芽孢菌屬，總計(jì)4個(gè)屬9個(gè)種，其中芽孢菌屬涉及種類(lèi)最多，共5個(gè)種；其次鏈霉屬，涉及2個(gè)種。圖4

圖4基于16S rDNA序列建立的拮抗菌NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
Fig.4NJ phylogenetic tree of antagonistic bacterium based on 16S rDNA sequence

2.3　果樹(shù)腐爛病原菌拮抗菌的復(fù)篩

果樹(shù)腐爛病病原菌拮抗菌的復(fù)篩采用平板對(duì)峙法進(jìn)行。以分離到的蘋(píng)果樹(shù)和李子樹(shù)腐爛病病原菌PF1和LF2為指示菌。先將病原菌菌餅接種至PDA平板中心，采用四點(diǎn)對(duì)峙法進(jìn)行拮抗菌的復(fù)篩，研究表明，所分離的拮抗菌對(duì)PF1和LF2抑制效果存在著區(qū)別，但總體差別不大。鏈霉菌A1和芽孢桿菌B4、B6對(duì)所得的腐爛病病原菌具有較好的抑制的效果，抑菌圈菌落比最大分別可以達(dá)到1.95、2.11和2.79。圖5

進(jìn)一步對(duì)菌株芽孢桿菌B4和B6對(duì)腐爛病抑制效果分析發(fā)現(xiàn)，盡管兩株菌均具有較好的抑菌效果，但兩者對(duì)病原菌的抑菌圈形狀不同，病原菌受菌株B4抑制時(shí)，抑菌圈邊緣較為整齊，真菌基絲和氣生菌絲基本在一個(gè)垂面，且受抑制處邊緣明顯有大量真菌孢子產(chǎn)生。而病原菌受B6抑制時(shí)，抑菌圈邊緣不整齊，真菌氣生菌絲比基絲明顯受抑制，菌絲體由內(nèi)至邊緣逐漸變薄，同時(shí)在兩株菌的相互作用的過(guò)程中，在菌株B6菌落周?chē)纬闪艘粋€(gè)明顯的暈圈，相關(guān)不同的抑制機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。圖6

圖5拮抗菌對(duì)果樹(shù)腐爛病病原菌抑菌活性
Fig.5Antagonistic activity of bacterium against to the pathogen of fruit tree canker

注：A:芽孢桿菌B4和 B6對(duì)Valsamali的拮抗平板; B:芽孢桿菌B6抑菌圈邊緣特征;C:芽孢桿菌B4抑菌圈特征;D:Valsamali受芽孢桿菌B6拮抗抑菌圈邊緣菌絲顯微特征；E:Valsamali受芽孢桿菌B4拮抗抑菌圈邊緣菌絲顯微特征

Note:A: Antagonistic plates of Bacillus B4 and B6 againstValsaMali; B: Edge characteristics of the inhibition zone by B6;C: Edge characteristics of the inhibition zone by B6;D: Microscopic characteristics of the edge mycelia ofValsaMaliaround inhibition zone by B6;E: Microscopic characteristics of the edge mycelia ofValsaMaliaround inhibition zone by B4

圖6芽孢桿菌B4和B6對(duì)Valsa mali抑制效果
Fig.6Inhibitory effect of B4 and B6 against Valsa mali

3　討 論

腐爛病作為我國(guó)北方林果樹(shù)木的常見(jiàn)病害之一，涉及林木種類(lèi)多，發(fā)病區(qū)域廣泛，最南至江蘇徐淮地區(qū)均發(fā)現(xiàn)腐爛病的發(fā)生[17]。已在常見(jiàn)林果樹(shù)木如蘋(píng)果樹(shù)、梨樹(shù)、楊梅樹(shù)、紅棗樹(shù)、核桃樹(shù)、楊樹(shù)、榆樹(shù)、國(guó)槐樹(shù)、胡楊樹(shù)等樹(shù)木均發(fā)現(xiàn)有腐爛病的發(fā)生[18]。相關(guān)研究表明，上述腐爛病的主要病原菌為由殼囊孢菌Cytospora屬(有性型為腐皮殼菌Valsa屬)引起，我國(guó)目前已知相關(guān)病原菌共涉及該屬C.mali、C、malicola、C.chrysosperma、C.schuzeri、C.atrocirrhata和C、persoonii(C.leucostoma)等5個(gè)種，而相同種間亦存在致病力差異。

目前，新疆林果是我國(guó)腐爛病發(fā)病主要地區(qū)之一，主要栽培果樹(shù)中均發(fā)現(xiàn)腐爛病。相關(guān)研究證明我區(qū)的果樹(shù)腐爛病存在著多種病原菌，郭開(kāi)發(fā)等[8]對(duì)新疆南疆核桃樹(shù)腐爛病菌進(jìn)行了分子學(xué)鑒定，確定其致病菌為金黃殼囊孢C.chrysosperma。唐俊煜等[9]對(duì)庫(kù)爾勒香梨樹(shù)腐爛病菌生物學(xué)特性與致病性的初步研究發(fā)現(xiàn)，其致病菌為金黃殼囊孢C.chrysosperma。劉應(yīng)敏等[10]對(duì)新疆蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病原菌的分離、鑒定及其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)菌株C能夠在新疆蘋(píng)果樹(shù)上造成危害。新疆林果業(yè)主要布局在南疆地區(qū)，目前對(duì)北疆地區(qū)果樹(shù)腐爛病的研究較少。

研究針對(duì)新疆克拉瑪依綠城實(shí)業(yè)有限公司生態(tài)果園內(nèi)蘋(píng)果樹(shù)和李子樹(shù)腐爛病的病原菌進(jìn)行了篩選鑒定，確定蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病原菌為Valsamali，李子樹(shù)腐爛病病原菌分別包括Valsamali和Valsaleucostoma。該研究不僅進(jìn)一步證明了新疆果樹(shù)腐爛病病原菌存在著多樣性，也在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了李子樹(shù)腐爛病病原菌，相關(guān)研究對(duì)新疆腐爛病研究具有明顯的指導(dǎo)意義。同時(shí)，研究篩選獲得了多株具有不同效果的拮抗菌，為我區(qū)果樹(shù)腐爛病的生物防治替代了科學(xué)依據(jù)和材料。

4　結(jié) 論

新疆克拉瑪依綠城實(shí)業(yè)有限公司生態(tài)果園內(nèi)蘋(píng)果樹(shù)和李子樹(shù)腐爛病的病原菌初步確定蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病原菌為Valsamali，李子樹(shù)腐爛病病原菌分別包括Valsamali和Valsaleucostoma。

所得各類(lèi)拮抗真菌菌株15株，分別歸屬于鏈霉屬、諾卡氏菌屬、類(lèi)芽孢菌屬及芽孢菌屬，總計(jì)4個(gè)屬9個(gè)種，其中芽孢菌屬涉及種類(lèi)最多，共5個(gè)種；其次鏈霉屬，涉及2個(gè)種。

篩選到高效拮抗細(xì)菌2株，芽孢桿菌B4和B6對(duì)腐爛病具有較好抑菌效果，其最大抑菌圈菌落比可分別達(dá)到2.11和2.79，但兩者對(duì)病原菌的抑菌圈形狀不同。

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