馬木爾·阿克木漢，庫爾班乃木·卡地爾，姚曉慧，王舒豐，王 凱，夏利寧

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊　830052；2.新疆焉耆縣畜牧獸醫(yī)站，新疆焉耆縣　841100)

0　引 言

【研究意義】葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種條件性人畜共患病原菌。廣泛存在于自然界以及人、動物的皮膚、鼻咽部黏膜及腸道內(nèi)，當機體的抵抗力下降或皮膚黏膜破損時，病菌便可乘虛而入，大量生長繁殖，不僅可引起人的局部毛囊炎、蜂窩織炎、肺炎、心包炎外，還可引起仔豬滲出性皮炎、豬心膜炎、奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎等多種動物的疾病，若治療不及時，常引起敗血癥而死亡[1-4]?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)很多省市如河南[5]、廣州[6]、青島[7]、寧夏[8]、新疆[9]等地對不同來源葡萄球菌的耐藥情況進行調(diào)查，多數(shù)研究表明葡萄球菌的耐藥率較高，且呈現(xiàn)逐年升高的趨勢?！颈狙芯壳腥朦c】有少數(shù)有關(guān)新疆豬源葡萄球菌的耐藥性調(diào)查，但僅局限于某一區(qū)域。焉耆作為新疆一個重要的養(yǎng)殖基地，并未開展豬源葡萄球菌的耐藥性研究。比較新疆焉耆地區(qū)某豬場不同生長期豬只鼻腔和直腸攜帶葡萄球菌的耐藥情況?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對新疆焉耆縣養(yǎng)豬場不同生長階段豬只不同部位分離的葡萄球菌作為研究對象，進行耐藥性的對比研究，有效提高抗菌藥物的治療效果。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1樣品

2016年7月在新疆焉耆回族自治縣某豬場進行樣品采集，分別采用鼻拭子和肛拭子在同一豬只的鼻腔和直腸進行樣品采集。采樣對象為40日齡仔豬(直腸樣100份)、2月齡仔豬(直腸樣200份，鼻腔樣100份)和妊娠豬(直腸樣100份，鼻腔樣100份)，從中分離試驗用葡萄球菌。

1.1.2菌株與培養(yǎng)基

參考標準質(zhì)控菌ATCC29213(購自杭州天和微生物試劑有限公司)。

Mueller-Hinton Broth MH培養(yǎng)基(購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；Baird-Parker(BP)瓊脂基礎、亞碲酸鹽卵黃增菌液(購自青島高科園海波生物有限公司)；氯化鈉(購自天津市光復科技發(fā)展有限公司)。

1.1.3藥品

氨基糖苷類：慶大霉素(Gentamicin)(GEN，含量99.5%)、阿米卡星(Amikacin)(AMK，含量65.5%)；喹諾酮類：氧氟沙星(Levo-floxacin)(DF，含量99.0%)；酰胺醇類：氟苯尼考(Florfenicol)(FFC，含量98.0%)；四環(huán)素類：四環(huán)素(Tetracycline)(TE，含量95.0%)；林可胺類：克林霉素(Clindamycin)(CM，含量80.0%)；福霉素類：利福平(Rifampicin)(RP，含量98.7%)；β內(nèi)酰胺類：阿莫西林(Amoxicillin)(MOX，含量86.6%)/克拉維酸(ClavulanicAcid)(A/C，含量100%)、苯唑西林(Benzene)(OX，含量99.5%)、頭孢噻呋(Ceftiofur)(EFT，含量89.0%)、青霉素(Benzylpenicillin)(BP，含量91.0%)。

上述藥品均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2　方 法

1.2.1葡萄球菌的分離鑒定

吸取8 μL樣品至滅菌的7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，初步篩選葡萄球菌。隨后用接種環(huán)蘸取7.5%氯化鈉培養(yǎng)液在BP瓊脂平板上，劃線，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，在BP瓊脂平板上挑取圓形、表面光滑、凸起、濕潤、顏色呈灰色至黑色的單個菌落于營養(yǎng)肉湯中，作為疑似葡萄球菌保存。同時對其進行革蘭氏染色，若鏡下呈現(xiàn)紫色，呈葡萄串狀排列，無芽胞，無莢膜的菌落，則確定其為葡萄球菌，使用60%甘油的進行保菌，于-20 ℃保存。

1.2.2藥物敏感性試驗

按抗生素敏感性測試歐洲協(xié)會(EUCAST)[10]推薦的微量肉湯稀釋法進行，對分離葡萄球菌進行上述11種抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)值測定，結(jié)果判定參照EUCAST(2016)標準表。表1

表1EUCAST(2016)微量肉湯稀釋法葡萄球菌屬質(zhì)控范圍及折點值
Table1EUCAST(2016)Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters

藥物名稱DrugName金黃色葡萄球菌ATCC29213的質(zhì)控標準SauATCC29213qualitycontrolstandardsMIC折點MICbreakpoint(mg/L)目標　Target范圍　RangeS≤R>慶大霉素Gentamicin0 25～0 50 125～111阿米卡星Amikacin21～4816氧氟沙星Levo-floxacin0 25～0 50 125～111氟苯尼考Florfenicol2～41～84～816四環(huán)素Tetracycline0 25～0 50 125～112克林霉素Clindamycin0 1250 06～0 250 250 5利福平Rifampicin0 0080 004～0 0160 060 5阿莫西林/克拉維酸Amoxicillin/ClavulanicAcid0 125～0 250 06～0 548苯唑西林Benzene0 125～0 250 06～0 524頭孢噻呋Ceftiofur0 25～0 50 125～148青霉素Benzylpenicillin0 25～10 25～20 1250 125

1.3　數(shù)據(jù)處理

耐藥率差異統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0軟件進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　葡萄球菌分離結(jié)果

研究表明，不同日齡豬的直腸菌分離率均在80.0%以上，鼻腔菌的分離率不到70.0%。表2

表2豬源葡萄球菌分離結(jié)果
Table2The isolates results of swine Staphylociccus

采樣部位Samplesite采樣對象Samplingobject采樣數(shù)Numberofsamples分離數(shù)Thenumberofisolates分離率Separationrate(%)直腸40日齡仔豬1008787 02月齡仔豬20016180 5妊娠豬1008484 083 8鼻腔2月齡仔豬1006464 0妊娠豬1007373 068 5

2.2　耐藥性比較

2.2.1不同養(yǎng)殖階段直腸源葡萄球菌耐藥性比較

研究表明，仔豬源菌對慶大霉素、克林霉素、苯唑西林、頭孢噻呋4種藥物的耐藥率顯著高于妊娠豬源菌對其的耐藥率(P﹤0.05)。此外，2月齡仔豬源菌對四環(huán)素、苯唑西林、氟苯尼考、氧氟沙星、青霉素這5種藥物表現(xiàn)出最高的耐藥率，依次為88.2%、72.1%、40.4%、41.0%、99.4%，其中對氟苯尼考、氧氟沙星2種藥物的耐藥率極顯著高于其它養(yǎng)殖階段采集的葡萄球菌(P﹤0.01)；40日齡仔豬源菌對慶大霉素、克林霉素、頭孢噻呋3種藥物表現(xiàn)出最高的耐藥率，依次為14.9%、67.8%、36.8%。直腸菌均對阿米卡星敏感。圖1

注：GEN：慶大霉素；AMK：阿米卡星；DF：氧氟沙星；FFC：氟苯尼考；TE：四環(huán)素；CM：克林霉素；RP：利福平；A/C：阿莫西林/克拉維酸；OX：苯唑西林；EFT：頭孢噻呋；BP：青霉素,下同

Note：GEN：Gentamicin；AMK：Amikacin；DF：Levo-floxacin；FFC：Florfenicol；TE：Tetracycline；CM：Clindamycin；RP：Rifampicin；A/C：Amoxicillin/ClavulanicAcid；OX：Benzene；EFT：Ceftiofur；BP：Benzylpenicillin。The same as below

圖1不同養(yǎng)殖階段直腸源葡萄球菌對被檢藥物耐藥率比較
Fig.1Comparison of drug resistance rate of rectal Staphylococcus aureus to tested drugs in different culture stages

2.2.2不同養(yǎng)殖階段鼻腔源葡萄球菌耐藥性比較

研究表明，2月齡仔豬源菌對四環(huán)素、克林霉素、氟苯尼考3種藥物的耐藥率極顯著高于妊娠豬源菌(P﹤0.01)，對慶大霉素、氧氟沙星的耐藥率略高于妊娠豬源菌；妊娠豬源菌對頭孢噻呋的耐藥率極顯著高于2月齡仔豬源菌(P﹤0.01)，對苯唑西林、利福平、阿莫西林/克拉維酸、青霉素4種藥物的耐藥率略高于2月齡仔豬源菌。所有分離鼻腔菌均對阿米卡星敏感。圖2

注：藥物名稱簡寫同圖1

Note: Drug abbreviation with the same fig1

圖2不同養(yǎng)殖階段鼻腔源葡萄球菌對被檢藥物耐藥率比較
Fig.2Comparison of resistance rate of nasal Staphylococcus aureus to tested drug in different culture stage

2.2.3相同養(yǎng)殖階段不同分離部位葡萄球菌耐藥性的比較

在2月齡仔豬不同分離部位的葡萄球菌中，直腸菌和鼻腔菌對阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸均敏感。直腸菌對四環(huán)素、苯唑西林、氧氟沙星、利福平、青霉素5種藥物的耐藥率高于鼻腔菌；鼻腔菌對慶大霉素、克林霉素、頭孢噻呋3種藥物的耐藥率高于直腸菌，對氟苯尼考的耐藥率極顯著高于直腸菌(P﹤0.01)。其中鼻腔菌對利福平均敏感。圖3

妊娠豬不同分離部位的葡萄球菌中，直腸菌對克林霉素、利福平、阿莫西林/克拉維酸3種藥物的耐藥率極顯著高于鼻腔菌(P﹤0.01)，對氟苯尼考、氧氟沙星2種藥物的耐藥率略高于鼻腔菌；鼻腔菌對四環(huán)素、苯唑西林、頭孢噻呋3種藥物的耐藥率極顯著高于直腸菌(P﹤0.01)，對青霉素的耐藥率顯著高于直腸菌(P﹤0.05)；各部位分離的葡萄球菌均對慶大霉素、阿米卡星敏感。圖4

注：藥物名稱簡寫同圖1

Note: Drug abbreviation with the same fig1

圖32月齡仔豬不同分離部位葡萄球菌的耐藥性比較
Fig.3Comparison of drug resistance of Staphylococcus aureus in 2-month-old swine with different separation sites

注：藥物名稱簡寫同圖1

Note: Drug abbreviation with the same fig1

圖4妊娠豬不同部位分離葡萄球菌的耐藥性比較
Fig.4Resistance Comparison of Staphylococcus Isolated from Different Parts of Pregnancy swine

2.3　多藥耐藥性比較

2.3.1不同養(yǎng)殖階段直腸源葡萄球菌多藥耐藥性比較

40日齡仔豬直腸菌以2耐、3耐為主；2月齡仔豬直腸菌以3耐、4耐為主，但是耐藥譜型繁多，0～10耐均有分布；妊娠豬直腸菌以0耐、1耐、2耐為主，且有3株為9耐。仔豬直腸菌3耐百分率極顯著高于妊娠豬直腸菌(P﹤0.01)，妊娠豬直腸菌0耐百分率顯著高于仔豬直腸菌(P﹤0.05)，1耐百分率極顯著高于仔豬直腸菌(P﹤0.01)，40日齡仔豬直腸菌2耐百分率顯著高于2月齡仔豬直腸菌(P﹤0.05)，2月齡仔豬直腸菌4耐、5耐百分率顯著高于妊娠豬直腸菌(P﹤0.05)。圖5

圖5不同養(yǎng)殖階段直腸菌多藥耐藥率比較
Fig.5Comparison of multidrug resistance rate of rectal bacteria in different culture stages

2.3.2不同養(yǎng)殖階段鼻腔菌多藥耐藥性比較

研究表明，2月齡仔豬鼻腔菌和妊娠豬鼻腔菌均以2耐、3耐、4耐為主，耐藥譜型相近，分布在0耐和6耐之間，2月齡仔豬鼻腔菌3耐百分率極顯著高于妊娠豬鼻腔菌(p﹤0.01)。6耐百分率極顯著高于妊娠豬鼻腔菌(P﹤0.05)，妊娠豬鼻腔菌1耐百分率顯著高于2月齡仔豬鼻腔菌(p﹤0.05)。圖6

圖6不同養(yǎng)殖階段鼻腔菌多藥耐藥率比較
Fig.6Comparison of multidrug resistance rates of nasal bacteria in different culture stage

2.3.3相同養(yǎng)殖階段不同分離部位分離的葡萄球菌耐藥性比較

研究表明，2月齡仔豬直腸菌和鼻腔菌均以3耐、4耐為主，但是直腸菌耐藥譜型繁多，0～10耐均有分布，鼻腔菌的譜型集中在0～6耐。鼻腔菌3耐百分率顯著高于同階段直腸菌(P﹤0.05)，直腸菌5耐百分率顯著高于同階段鼻腔菌(P﹤0.05)。圖7

圖72月齡仔豬不同分離部位的葡萄球菌多藥耐藥率比較
Fig.7Comparison of multidrug resistance rate of staphylococcus aureus among different segregation sites in 2 month old swine

研究表明，妊娠豬直腸菌以0耐、1耐、2耐為主，鼻腔菌以2耐、3耐、4耐為主；直腸菌0耐百分率顯著高于鼻腔菌(P﹤0.05)，1耐百分率極顯著高于鼻腔菌(P﹤0.01)，而鼻腔菌3耐百分率顯著高于直腸菌(P﹤0.05)，4耐百分率中極顯著高于直腸菌(P﹤0.01)。圖8

圖8妊娠母豬不同分離部位的葡萄球菌多藥耐藥率
Fig.8Comparison of multidrug resistance rate of staphylococcus aureus among different segregation sites in pregnant swine

3　討 論

細菌在抗生素壓力等環(huán)境因素的影響下獲得和產(chǎn)生耐藥性是其自身的一種防御機制[11]。在我國，養(yǎng)豬業(yè)大量使用抗生素用以治療疾病和促進仔豬生長，這種大量使用抗生素的養(yǎng)殖模式導致動物體攜帶的細菌耐藥性的不斷提高，人和動物體之間包括養(yǎng)殖、屠宰等接觸行為，會使人體攜帶耐藥細菌，一旦因此引起疾病，會增加治療難度。

3.1　對被檢藥物的耐藥

3.1.1不同養(yǎng)殖階段豬源葡萄球菌的耐藥

通過比較各養(yǎng)殖階段直腸菌和鼻腔菌的耐藥結(jié)果，發(fā)現(xiàn)仔豬直腸菌對大多數(shù)被檢藥物的耐藥率都高于妊娠豬源菌的耐藥率，主要是養(yǎng)殖場為了促進仔豬生長而大量使用抗生素造成的結(jié)果[12]。仔豬鼻腔菌對除頭孢噻呋外的其他被檢藥物的耐藥率高于或近似于妊娠豬源菌的耐藥率，這是由于該養(yǎng)殖場將頭孢噻呋作為治療豬只呼吸道疾病的常用藥物且該藥物直接作用于呼吸道所導致。所有的葡萄球菌均對阿米卡星敏感，養(yǎng)殖場用藥調(diào)研顯示該地區(qū)養(yǎng)殖場不曾用此藥物。

3.1.2相同養(yǎng)殖階段不同部位分離葡萄球菌的耐藥

2月齡仔豬直腸菌和鼻腔菌對被檢藥物的耐藥趨勢一致，其原因為仔豬使用抗生素的目的主要在于促進其生長，缺乏針對性，屬于廣泛用藥。而對妊娠豬用藥的目的是治療，更具有針對性，所以妊娠豬源菌的耐藥性與被檢藥物在機體中某一部位殘留時間的長短程趨勢相關(guān)，四環(huán)素、苯唑西林、頭孢噻呋、青霉素等藥物主要用于豬只的呼吸道疾病，且在呼吸系統(tǒng)殘留時間較長，故而導致鼻腔菌的耐藥性顯著高于直腸菌。

試驗中不同分離部位的葡萄球菌對被檢抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥，對同一種抗菌藥耐藥性存在一定的差異。該結(jié)果與蔡建星等調(diào)查結(jié)果[13]相似。

3.2　多藥耐藥

3.2.1不同養(yǎng)殖階段分離的葡萄球菌多藥耐藥

隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用，細菌耐藥率不斷上升，多藥耐藥菌已逐漸成為引起感染的重要病原菌[15-16]。通過比較不同養(yǎng)殖階段分離的葡萄球菌多藥耐藥情況，發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)殖場分離的葡萄球菌多藥耐藥情況十分嚴重，但與河南省[17]相比較低，與蔡建星等[18]報道相似，在2耐、3耐分布較廣且耐藥譜型繁多。其中仔豬源菌中有5株為9耐，1株為10耐，這種超級耐藥細菌一旦感染免疫力低下的動物機體，則會使動物出現(xiàn)敗血癥、肺炎等疾病，甚至導致動物死亡[19]。

3.2.2相同養(yǎng)殖階段不同分離部位葡萄球菌的多藥耐藥

仔豬直腸菌和鼻腔菌均以3耐、4耐為主，但是直腸菌耐藥譜型繁多，0～10耐均有分布，而鼻腔菌的耐藥譜型較為集中，這與大部分抗菌藥物是以原藥或者其代謝物的形式排出動物體內(nèi)，排泄物中的耐藥菌污染周圍環(huán)境后，又再次通過各種途徑進入腸道，增加腸道菌群的耐藥率有關(guān)[20]。妊娠豬直腸菌以0耐、1耐、2耐為主，鼻腔菌以2耐、3耐、4耐為主，環(huán)境與用藥調(diào)研顯示：這與該豬場豬只多發(fā)呼吸道疾病有關(guān)；直腸菌中有3株為9耐。不同部位分離的葡萄球菌多藥耐藥結(jié)果顯示在畜牧養(yǎng)殖業(yè)應加強監(jiān)測葡萄球菌的耐藥性及相關(guān)耐藥表型的調(diào)查研究，加強藥物合理使用的監(jiān)督、管理[21]。

4　結(jié) 論

焉耆地區(qū)該養(yǎng)豬場葡萄球菌耐藥情況較為嚴重，直腸菌和鼻腔菌對四環(huán)素、克林霉素、苯唑西林、青霉素4種抗菌藥具有較高的耐藥性，耐藥率依次為51.6%、31.3%、62.3%、94.7%；且多藥耐藥率較高，呈3耐和4耐的菌株占總數(shù)的26.38%和22.01%，同時耐藥譜型繁多，0～10耐均有分布，豬場減少以促進生長為目的使用抗生素，臨床用藥以藥敏試驗結(jié)果為依據(jù)選擇敏感藥物及時治療。對于其他部位的疾病幼畜建議使用阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸進行治療，妊娠豬則可以在阿米卡星、氧氟沙星、氟苯尼考、四環(huán)素之間進行選擇用藥。同時采取多途徑、交叉用藥、聯(lián)合用藥等合理方案，輔以科學的飼養(yǎng)管理，保證周圍環(huán)境衛(wèi)生，加強綜合配套措施管理，提高仔豬成活率和育成率。

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