付紫梅，袁 倫，邵冬南，郝小軍，崔百明，向本春

(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，新疆石河子　832003；2.威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，重慶　400039；3.新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)普通高校重點實驗室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子　832003)

0　引 言

【研究意義】新疆是我國最大的加工番茄種植基地，加工番茄作為新疆經(jīng)濟(jì)的支柱性產(chǎn)業(yè)之一，對新疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著舉足輕重的影響[1]。然而病毒病害一直以來都是影響加工番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的限制性因素，馬鈴薯Y病毒(PotatoVirusY, PVY)是馬鈴薯 Y病毒屬(Potyviruses)的典型代表，同時也是感染新疆加工番茄的主要病毒種類之一[2]。利用基因工程的手段，從分子水平上培育新的抗病品種，是需要迫切解決的問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein9)作為繼鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)之后的第三代基因組編輯技術(shù)，自2013年被報道以來，由于簡便、高效的特點，在動植物基因組編輯中被廣泛的應(yīng)用[3-4]，到目前為止，已在水稻、土豆、玉米、番茄等經(jīng)濟(jì)作物功能基因的編輯中取得顯著成效[5-8]。Mccallum C M等[9]通過TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)技術(shù)靶向番茄eIF4E基因，獲得了抗PVY的eIF4E功能失活突變體。Mazier M等[10]通過RNA干擾的手段下調(diào)eIF4E1和eIF4E2基因，使得番茄植株對馬鈴薯Y病毒屬病毒獲得了更廣譜的抗性。然而利用新興的基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9靶向編輯PVY抗病相關(guān)基因eIF4E1(eukaryotic translation initiation factors 4E)，從分子水平上改良加工番茄品種的研究卻鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】翻譯起始因子是一個小的多基因家族，在功能上具有冗余[11]，在番茄當(dāng)中已鑒定出的3個成員，分別是eIF4E1、eIF4E2和eIF(iso)4E，其中eIF4E1和eIF4E2編碼eIF4E蛋白，eIF(iso)4E編碼eIF(iso)4E蛋白[12]。宿主細(xì)胞mRNA既能夠利用eIF4E的同時也能夠利用eIF(iso)4E來起始自身蛋白質(zhì)的翻譯，在番茄當(dāng)中，馬鈴薯Y病毒VPg(viral genome-linked protein,VPg)已經(jīng)演變?yōu)樘禺愋越Y(jié)合于eIF4E來幫助病毒蛋白的翻譯[10]。研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的特異性靶向編輯番茄真核翻譯起始因子elF4E1基因的表達(dá)載體，在阻礙了馬鈴薯Y病毒VPg與加工番茄eIF4E相互作用的同時為新疆加工番茄抗病品種的培育提供了新方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過瞬時轉(zhuǎn)化的方法來快速驗證靶向eIF4E1基因的CRISPR-Cas9載體的有效性，為利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)成功敲除eIF4E1基因，獲得抗PVY病毒非轉(zhuǎn)基因純合體植株提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1加工番茄

研究所用的加工番茄(Solanumlycopersicum)品種里格爾(87-5)購自石河子市亞心種業(yè)有限公司。

1.1.2菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101均為該實驗室-80℃保存菌種。

研究所用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)相關(guān)載體Px330cas9由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡圣偉老師饋贈。sgRNA表達(dá)框由上海生工生物工程股份有限公司合成并克隆到pUC19載體上。

1.2　方 法

1.2.1引物設(shè)計

根據(jù)eIF4E1靶序列設(shè)計合成引物sg_4E1_1S/sg_4E1_1A，根據(jù)hcas9序列設(shè)計合成引物hCas9-S/ hCas9-A，根據(jù)eIF4E1基因序列設(shè)計檢測引物DT_Sl4E1_F/ DT_Sl4E1_R。根據(jù)載體骨架設(shè)計引物Colony-F/ Colony-F，用于轉(zhuǎn)化后單克隆的菌斑PCR鑒定實驗。

表1實驗中所用引物
Table1Sequences of primers used in this study

引物Primer序列Sequence(5＇-3＇)酶切位點Restrictionenzymesg＿4E1＿1STTTGAGAAGTTGAAGGCCGCCGAHaeⅢsg＿4E1＿1AAAACTCGGCGGCCTTCAACTTCTHaeⅢhCas9-SGGGGATCCACCATGGACTATAAGGAChCas9-AGTACATATCCCGCCCATTCTGColony-FCGCCAGGGTTTTCCCAGTCColony-RCCGGCTCGTATGTTGTGTGGDT＿Sl4E1＿FGCTTCCATATTCTGAACTAGDT＿Sl4E1＿RGTAGGGTTATCAAACCAAAA

1.2.2靶序列選取

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載eIF4E1基因序列 (NC015440)，利用Vector軟件在基因編碼區(qū)的5'端找到NGG序列，即PAM(protospacer adjacent motifs)，研究表明，番茄eIF4E1基因全長 3 340 bp，共含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性切割原則，在綜合考慮靶位點選取過程中的GC含量、鑒定過程中酶切位點的選取以及靶序列最好位于基因序列的5'等因素的情況下。研究的靶序列位于加工番茄eIF4E1基因距轉(zhuǎn)錄起始位點46 bp的第一個外顯子上(含HaeⅢ酶切位點)，并將其命名為sgR-eIF4E1:GAGAAGTTGAAGGCCGCCGA。圖1

圖1加工番茄eIF4E1基因靶序列示意
Fig.1The structural diagram of the Solanum lycopersicum eIF4E1 locus targeted for editing

1.2.3載體構(gòu)建

將上海生工生物工程股份有限公司合成的sgRNA表達(dá)框(含番茄U6啟動子)克隆到pUC19載體上，將其命名為pUC-sgRNA。以Px330為模板，hcas9-S/hcas9-A為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過NcoⅠ/BstEⅡ克隆到pCAMBIA1302載體上，通過EcoRV酶切驗證后，命名為p1302-Cas9。通過引物退火的方式將sg_4E1_1S/sg_4E1_1A結(jié)合成帶粘性末端的雙鏈DNA片段后通過AarI酶克隆到pUC-sgRNA載體上，將其命名為pUC-SgR-eIF4E1。pUC-SgR-eIF4E1和p1302-Cas9載體分別用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切，膠回收預(yù)期大小一致的片段，4℃過夜連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)后，選取陽性克隆送北京華大基因公司測序驗證。并將其命名為p1302-sgR-Cas9-eIF4E1。測序正確的p1302-sgR-Cas9-eIF4E1質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，選取陽性克隆于 -80℃甘油管中保存?zhèn)溆?。?，圖2

圖2植物表達(dá)載體p1302-sgRNA-Cas9-eIF4E1結(jié)構(gòu)示意
Fig.2The structural diagram of the Plant expression vector p1302-sgRNA-Cas9-eIF4E1

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄瞬時轉(zhuǎn)化

1.2.4.1無菌苗種植

超凈工作臺中，將番茄種子用 2% 的次氯酸鈉消毒 15 min，期間不停地?fù)u晃，無菌水沖洗7～8次，用無菌鑷子將種子接種于1/2MS培養(yǎng)基，28℃、黑暗條件下培養(yǎng)2 d，待種子發(fā)芽后，28℃、長日照下(光照16 h/黑暗8 h)培養(yǎng)至7～8片真葉備用。

1.2.4.2農(nóng)桿菌侵染液制備

取上述 -80℃甘油管中保存的農(nóng)桿菌(含重組質(zhì)粒p1302-sgR-Cas9-eIF4E1)，在固體LB培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素；50 mg/L慶大霉素；25 mg/L利福平)上劃線，做好標(biāo)記。28℃、黑暗條件下倒置培養(yǎng)2 d，挑取單斑，接種于液體LB培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素；50 mg/L慶大霉素；25 mg/L利福平)中，28℃，220 r/min培養(yǎng)2 d。將活化的菌液以1∶10的比例轉(zhuǎn)移至液體LB培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素；50 mg/L慶大霉素；25 mg/L利福平)，28℃擴(kuò)大培養(yǎng)16～24 h至菌體生長至穩(wěn)定期，OD600值為1.5。室溫，4 000 g，離心 10 min，收集菌體。用1體積現(xiàn)配的5%蔗糖溶液懸浮菌體至無菌萌發(fā)盒中，用前加入10 μL Silwet L-77(終濃度為0.002%)。

1.2.4.3瞬時轉(zhuǎn)化過程

在工作臺內(nèi)將無菌苗平放于含有農(nóng)桿菌浸染液的萌發(fā)盒中，蓋上蓋。將含有菌液及番茄植株的萌發(fā)盒用隔膜真空泵在0.05 Mpa的壓力下抽真空4 min。用鑷子從萌發(fā)盒中取出植株放入另一個無菌萌發(fā)盒中，蓋上蓋，抖動，使植株表面過多的菌液滴下并用衛(wèi)生紙吸干表面殘余的菌液。20～25℃、黑暗條件下過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至1/2MS(含 300 mg/L羧芐霉素)固體培養(yǎng)基中，28℃、長日照下(光照16 h/黑暗8 h)培養(yǎng)生長。

1.2.5靶序列突變檢測

以CTAB法提取的葉片基因組DNA為模版， DT_Sl4E_F和DT_Sl4E_R為引物， 94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)后，72℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增加工番茄含靶序列的eIF4E1基因部分片段。將PCR產(chǎn)物用回收試劑盒回收純化后，HaeⅢ進(jìn)行酶切，膠回收試劑盒回收未切開的片段與pGEM-T進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α后，用DT_Sl4E_F和DT_Sl4E_R引物(表1)進(jìn)行菌斑PCR鑒定，隨機(jī)挑取陽性克隆穿刺管送至北京華大生物公司測序。根據(jù)單克隆測序結(jié)果來比對分析靶序列的編輯情況。

2　結(jié)果與分析

2.1　載體的構(gòu)建

利用PstⅠ酶切鑒定已構(gòu)建的p1302-Cas9載體(圖3A)，得到9 512、1 682、1 422、1 212和24 bp大小的6條帶，其特征性條帶1 682、1 422和1 212 bp與預(yù)期大小一致。以sg_4E_1S和Colony-R為引物進(jìn)行菌斑PCR來鑒定中間載體pUC-SgR-eIF4E1重組子，得到預(yù)期大小為150 bp的目標(biāo)條帶。利用特異性引物sg_4E_1A和Colony-R(表1)進(jìn)行菌斑PCR鑒定植物表達(dá)載體p1302-sgR-Cas9-eIF4E1重組子，得到預(yù)期大小為374 bp的目標(biāo)條帶，并對陽性克隆測序驗證，序列比對結(jié)果表明，p1302-sgR-Cas9-eIF4E1載體構(gòu)建成功，其中sgR-eIF4E1靶序列的表達(dá)框含有番茄U6啟動子，用以特異性識別和結(jié)合靶序列。Cas9表達(dá)框含有花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子和終止子，用以對靶序列進(jìn)行特異性切割。提取p1302-sgR-Cas9-eIF4E1載體質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，對轉(zhuǎn)化的菌斑進(jìn)行菌斑PCR驗證，得到預(yù)期大小為374 bp的電泳條帶(圖3B)，說明載體質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，可用于后續(xù)的瞬時轉(zhuǎn)化實驗。表1，圖3

注：A：p1302-Cas9載體的PstⅠ酶切鑒定； M：DL15000；P：p1302-Cas9/PstⅠ； B：菌落PCR鑒定RISPR/Cas9重組載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌落；M：DL2000；N：空白對照；G：GV3101，陰性對照；1～4：重組載體菌落；P：p1302-sgRNA-Cas9-eIF4E1質(zhì)粒，陽性對照

Note: A:Restriction enzyme digestion of thep1302-Cas9; B:PCR verification ofAgrobacteriumtumefacienscolonies transformed with CRISPR/Cas9 recombinant vecter; M:DL2000 marker; N: Blank control; G:GV3101, negative control; 1-4: Recombinant vecterAgrobacteriumtumefacienscolony; P:p1302-sgRNA-Cas9-eIF4E1 plasmid, positive control

圖3靶向eIF4E1基因載體構(gòu)建
Fig.3Construction of CRISPR-Cas9 vectors targeting eIF4E1 gene

2.2　靶序列突變檢測

以瞬時轉(zhuǎn)化加工番茄植株和野生型加工番茄植株的基因組DNA為模板， DT_Sl4E_F和DT_Sl4E_R為引物，擴(kuò)增包含靶序列的加工番茄eIF4E1基因部分片段，擴(kuò)增結(jié)果(圖4A)，所有擴(kuò)增樣品均出現(xiàn)了與預(yù)期大小一致的408 bp的條帶，PCR產(chǎn)物回收純化后用HaeⅢ進(jìn)行酶切(圖3B)，研究表明，2個瞬時轉(zhuǎn)化植株相對于野生型對照均出現(xiàn)了HaeⅢ未切開的408 bp的條帶，表明這兩個植株中都有部分細(xì)胞被編輯。膠回收未切開的408 bp大小的條帶與pGEM-T進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α后，隨機(jī)挑取11個克隆，用DT_Sl4E_F和DT_Sl4E_R引物(表1)進(jìn)行菌斑PCR鑒定(圖4C)，這11個克隆中有9個為陽性克隆。隨后將這9個陽性克隆穿刺管送至北京華大生物公司測序。表1，圖4

注：A：靶序列處eIF4E1基因片段的PCR擴(kuò)增；B：HaeⅢ對PCR產(chǎn)物的酶切篩選；C：單克隆菌斑PCR鑒定；M：DL1000 marker；N：空白對照；W：陰性對照；P：陽性對照

Note: A: PCR amplification ofeIF4E1 gene fragment around the target sequence; B: The screening of PCR products byHaeⅢ; C: The PCR identification of Monoclonal plaque; M: DL1000 marker; N: Blank control; W: Negative control; P: Positive control

圖4靶序列突變檢測
Fig.4The mutation detection of target sequence

2.3　測序結(jié)果比對

將這9個克隆的靶位點處的核苷酸序列和氨基酸序列分別與野生型進(jìn)行了比對，核苷酸序列比對結(jié)果(圖5A)，9個陽性克隆在PAM上游的第6～8個核苷酸處均發(fā)生突變，并且所有的突變均為單堿基的替換。相對應(yīng)的靶位點處的氨基酸序列比對結(jié)果(圖5B)，研究表明，除6號克隆的氨基酸序列沒有改變外，2、7、8、10、11號克隆靶位點處的丙氨酸被纈氨酸所替換，1和4號克隆靶位點處的丙氨酸被天冬氨酸替換，9號克隆的丙氨酸被蘇氨酸替換。圖5

注：A：核苷酸序列比對結(jié)果 (淺灰色為突變堿基位置)；B：氨基酸序列比對結(jié)果(淺灰色為氨基酸突變區(qū))

Note: A: The comparison results of the nucleotide sequence (Light gray marks the location of base mutation); B: The comparison results of the amino acid sequence (Light gray marks the region of amino acid)

圖5靶位點區(qū)域核苷酸序列與氨基酸序列比對結(jié)果
Fig.5The comparison results of the nucleotide sequence and amino acid sequence at target region

3　討 論

CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)來源于細(xì)菌和古細(xì)菌，是自然界普遍存在于原核生物的一種免疫防衛(wèi)系統(tǒng)，通過激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答來抵抗質(zhì)粒DNA或病毒的入侵[13]。經(jīng)過人工改造后的Ⅱ型RISPR/Cas9系統(tǒng)在編輯過程中，sgRNA通過和靶序列的堿基配對結(jié)合到DNA上后引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合并識別靶序列下游的PAM(protospacer adjacent motifs)基序，在PAM上游約3 bp處切割DNA雙鏈，形成平端的DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)，DSB在通過同源重組(homology-directed repair，HDR)和非同源性末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)進(jìn)行修復(fù)的過程中。形成靶序列處堿基的替換、插入或刪除，從而形成對DNA靶位點基因編輯[14-16]。 測序結(jié)果顯示所獲得的9個陽性單克隆突變情況均為單堿基的替換，這與潘洪杏等[17]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)定向敲除煙草eIF4E-6 基因后的編輯情況基本一致。推測可能是因為eIF4E1作為翻譯起始因子對植物自身生長比較重要，在Cas9蛋白酶切割DNA雙鏈后，植物出于一種防御反應(yīng)優(yōu)先利用同源重組來進(jìn)行修復(fù)，從而出現(xiàn)單堿基替換的突變方式。

為了驗證利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)構(gòu)建的靶向eIF4E1基因載體的有效性，研究采用了真空滲透的瞬時轉(zhuǎn)化方法來對編輯情況進(jìn)行評估。HaeⅢ酶切鑒定結(jié)果和序列比對結(jié)果都表明研究所采取的瞬時轉(zhuǎn)化方案是可行的，這相對于采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化方法更加的方便快捷[18]，所以實驗所采用的瞬時轉(zhuǎn)化方法可應(yīng)用于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化之前的靶序列評估實驗，為CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在后續(xù)番茄品種改良過程中更加精準(zhǔn)的編輯提供了方便。

4　結(jié) 論

研究利用真空滲透的瞬時轉(zhuǎn)化方法對基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建的p1302-sgRNA-Cas9-eIF4E1植物表達(dá)載體進(jìn)行了驗證。從HaeⅢ酶切檢測結(jié)果可以看出，未切開的408 bp條帶較亮，說明這兩個植株中被編輯的細(xì)胞較多，這表明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的靶向編輯eIF4E1基因的載體的編輯效率較高。所獲得的9個單克隆的序列比對結(jié)果表明，所有測序克隆在PAM上游6～8 bp的堿基處發(fā)生了單堿基的替換，氨基酸比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有8個克隆在相同的位點出現(xiàn)了單個氨基酸的突變，表明研究構(gòu)建的p1302-sgRNA-Cas9-eIF4E1能夠特異性的靶向加工番茄eIF4E1。這為后續(xù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在加工番茄品種改良過程中的成功應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

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