溫正旺　陳益平　徐志偉　石海礬　狄軍波　陳均亞　陳潔　蔡曉紅

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒童感染科(溫正旺、陳益平、徐志偉、石海礬、狄軍波、陳均亞、陳潔)，兒童呼吸科(蔡曉紅)

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是非嗜肝病毒感染引起兒童肝損害的常見病原體，原發(fā)性急性EBV感染可導(dǎo)致82%的患兒出現(xiàn)肝功能損傷[1]，大部分患兒的癥狀會在治療1周內(nèi)減退[2]。目前對EBV感染導(dǎo)致肝功能損傷的機制尚未完全明確。探索EBV感染后機體內(nèi)與肝功能損害分子的表達情況，將為EBV感染導(dǎo)致肝功能損傷的防治提供新的思路和策略，有助于闡明EBV感染誘導(dǎo)肝功能損傷的內(nèi)在分子機制。Caspase3/6是導(dǎo)致肝細胞凋亡的主要分子蛋白，但是否與原發(fā)性EBV感染導(dǎo)致的肝功能損傷存在相關(guān)性，目前尚未明確。本研究通過收集患兒肝功能數(shù)據(jù)，并采用ELISA法檢測患兒血液中肝細胞損傷相關(guān)分子蛋白的表達，探索原發(fā)性EBV感染肝功能損害與caspase3/6表達變化的相關(guān)性及其臨床意義。

1　材料與方法

1.1研究對象收集2016年7月至2017年6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院治療的原發(fā)性EBV感染患兒249例，EBV-IgM檢測都為陽性，其中伴有肝功能損傷的168例為肝功能異常組，分別檢測其急性期及恢復(fù)期實驗室指標，恢復(fù)期抽血時間為住院治療第7天，肝功能正常的81例為肝功能正常組，年齡都在1周歲到14周歲之間；肝功能異常組按年齡再分為4個亞組，包括幼兒組(1到3周歲)37例、學(xué)齡前組(3周歲到7周歲)50例、學(xué)齡組(7周歲到10周歲)36例、青少年組(10周歲到14周歲)45例。收集相關(guān)的肝功能數(shù)據(jù)：AST、ALT、GGT、TBLL、DBLL。標本采集獲得患者或家屬知情同意，本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2ELISA方法檢測血清caspase-3和caspase-6蛋白的表達水平Caspase-3和caspase-6 ELISA試劑盒為美國PeproTech公司生產(chǎn)；抗Caspase-3和caspase-6抗體購自英國abcom公司。取caspase-3和caspase-6酶聯(lián)免疫試劑盒，室溫下靜置30 min，每孔加50 μl標準樣品或待測樣品，留兩孔為空白對照孔；塑料薄膜覆蓋微孔板，孵育2 h；洗板4次，反轉(zhuǎn)酶標板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔加50 μl生物素標記的抗caspase-3和caspase-6抗體，塑料膜封板，孵育2 h；洗板4次，反轉(zhuǎn)酶標板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔依次序加入顯色劑A和B，避光室溫孵育30 min；加入反應(yīng)終止液100 μl，自動酶標儀于 450 nm處測定各孔的光密度(optical density，OD)值；以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)樣品所測OD值確定其濃度。

2　結(jié)果

2.1肝功能異常組急性期和恢復(fù)期各項肝功能指標比較肝功能異常組中急性期和恢復(fù)期進行比較ALT差異具有顯著性(F=122.4，P<0.001)，其余差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

2.2肝功能異常組中各年齡分組間ALT差異比較

肝功能異常組按年齡分為4個亞組，其中僅青少年組ALT與其他各組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=143.4，P<0.001)，余指標在各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.3肝功能異常組和肝功能正常組間caspase-3/6比較以及肝功能異常組急性期和恢復(fù)期caspase-3/6比較肝功能異常組caspase-3和caspase-6的表達水平明顯高于肝功能正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=153.4,P<0.001,F=210.1，P<0.001)(見表3)。肝功能異常組中急性期caspase-3和caspase-6的表達水平明顯高于恢復(fù)期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=133.7,P<0.001,F=160.6，P<0.001)(見表3)。

2.4肝功能異常組中各年齡組間caspase-3/6比較肝功能異常組中按年齡分4個亞組，只有青少年組的caspase-3和caspase-6與其他組的比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=152.1,P<0.001；F=122.9，P<0.001),余各組之間的caspase-3和caspase-6兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表1　肝功能異常組中急性期與恢復(fù)期ALT、AST、TBLL、GGT和DBLL的統(tǒng)計比較

表2　肝功能異常組中幼兒組、學(xué)齡前組、學(xué)齡組和青少年ALT、AST、TBLL、GGT和DBLL的統(tǒng)計比較

注：青少年組#P<0.05vs 幼兒組;*P<0.05vs 學(xué)齡前組;▲P<0.05vs 學(xué)齡期;其余P>0.05

Note:#P<0.05 adolescent group vs. young clindren group;*P<0.05 adolescent group vs. preschool group;△P<0.05 adolescent group vs. shcool age goup;P>0.05 for all the other comparisons

表3　肝功能異常組中caspase-3和caspase-6的表達水平的比較和急性期caspase-3和caspase-6的表達水平比較

2.5肝功能異常組急性期和恢復(fù)期caspase-3/6與ALT相關(guān)性分析肝功能異常組中急性期caspase-3和caspase-6的表達水平與ALT存在線性相關(guān)(r=0.982，P<0.001，r=0.965，P<0.001)(見圖1)。

3　討論

EBV屬于皰疹病毒4型，是臨床上導(dǎo)致兒童肝功能損傷的常見非嗜肝病毒。肝功能損害是原發(fā)性EBV感染最常見的并發(fā)癥，但EBV感染如何誘導(dǎo)肝功能的損傷，其分子機制目前尚未完全明確。最近的國內(nèi)研究提示EBV感染與乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的肝功能損傷存在相似性甚至可能通過B淋巴細胞群存在協(xié)同作用[3]；Zekri[4]在研究丙肝患者時發(fā)現(xiàn)，如果合并有EBV活動性感染，患者的病情會更重，肝功能呈現(xiàn)進行性升高；在2000年甚至更早已有研究提示EBV感染可以通過誘發(fā)與機體免疫能力相關(guān)的因子從而導(dǎo)致機體各臟器功能的損傷，臟器的損傷主要表現(xiàn)為細胞的凋亡[5]。

表4　肝功能異常組中幼兒組、學(xué)齡前組、學(xué)齡組和青少年caspase-3和caspase-6的表達水平比較

注：青少年組#P<0.001vs 幼兒組;*P<0.001vs 學(xué)齡前組;▲P<0.001 vs 學(xué)齡期；余P>0.05

Notes.#P<0.001 adolescent group vs. young children group;*P<0.001 adolescent group vs. preschool group;▲P<0.001 adolescent group vs. school age group;P>0.05 for all the other comparisons

圖1　肝功能異常組急性期ALT與caspase-3/6的相關(guān)性分析Fig.1　The analysis of correlation between ALT and caspase-3/6 of liver fonction abnormal group

Caspase-6與caspase-3是細胞凋亡發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子，是絕大多數(shù)凋亡信號通路的共同調(diào)節(jié)因子，將胞外凋亡刺激轉(zhuǎn)化成胞內(nèi)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，通常以酶原無活性的形式存在，在受到相關(guān)凋亡信號刺激后會被激活，通過降解蛋白分子的底物,從而誘導(dǎo)細胞凋亡；其中caspase-3還能通過水解胞內(nèi)的細胞生存蛋白，進而誘導(dǎo)細胞的凋亡。動物研究文獻提示肝炎患者中的肝細胞損傷多數(shù)表現(xiàn)為凋亡形式，且和caspase系列分子依賴的肝細胞凋亡密切相關(guān)，其中 caspase-3和caspase-6作用最為明顯[6]，如甲肝、乙肝的患者血清中caspase-3/6的表達水平明顯升高[7-8]，Masuoka[9]甚至通過caspase抑制劑來治療丙肝并取得一定臨床效果，在丙型肝炎肝功能損傷的機制研究中還發(fā)現(xiàn)caspase-6可以誘導(dǎo)JNK(c-Jun氨基末端激酶,c-Jun N-terminal kinase)的激活從而導(dǎo)致肝功能損傷[10]；但caspase3/6與EBV感染導(dǎo)致的肝功能損害是否存在相關(guān)性，目前尚未明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性EBV感染患兒血清中 caspase-3和caspase-6的表達水平明顯上升，且肝功能異常組中ALT、caspase-3和caspase-6的表達水平明顯高于肝功能正常組。既往在對丙肝的研究提示，肝炎患者中caspase-3和caspase-6表達水平的上升可直接誘導(dǎo)細胞的凋亡，導(dǎo)致肝功能的損傷，而采用caspase的抑制劑后，caspase-3和caspase-6表達下降，部分患者肝功能恢復(fù)正常。在肝功能異常組患兒中，急性期患兒的caspase-3/6以及ALT表達水平明顯高于恢復(fù)期患兒，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)當EBV感染后，急性期caspase3/6的表達與ALT的升高存在線性相關(guān)，提示原發(fā)性EBV感染所致肝功能的損傷與caspase3/6之間存在密切的內(nèi)部聯(lián)系。同時根據(jù)年齡分組，青少年組的caspase-3、caspase-6以及ALT表達水平明顯高于其他3組，與中國香港兒童EBV感染導(dǎo)致肝功能損傷的研究中發(fā)現(xiàn)的隨著年齡的增長肝功能的損害越明顯的結(jié)果一致[11]。

因此，caspase-3/6的高表達與兒童原發(fā)性EBV感染所致的肝功能損害存在密切相關(guān)，同時ALT的升高與caspase-3/6的表達水平存在線性相關(guān)。

利益沖突:無

[1]Leonardsson H, Hreinsson JP, Love A, et al. Hepatitis due to Epstein-Barr virus and cytomegalovirus: clinical features and outcomes[J]. Scand J Gastroenterol,2017,52(8):893-897.DOI: 10.1080/00365521.2017.1319972.

[2]Stock I. Infectious mononucleosis--a “childhood disease” of great medical concern[J]. Med Monatsschr Pharm,2013,36(10):364-368.

[3]張明霞，刁志宏，何海棠，等. EBV轉(zhuǎn)化慢性乙型肝炎患者B淋巴母細胞系的建立[J]. 細胞與分子免疫學(xué)雜志,2006,22(3):330-332.DOI：10.3321/j.issn:1007-8738.2006.03.018.

[4]Zekri AR, Abdullah D, Osman A, et al. Epstein-Barr virus and Interleukin-28B polymorphism in the prediction of response to interferon therapy in hepatitis C patients[J]. Arab J Gastroenterol,2015,16(3-4):84-89.DOI: 10.1016/j.ajg.2015.09.013.

[5]Mizukawa Y, Shiohara T. Virus-induced immune dysregulation as a triggering factor for the development of drug rashes and autoimmune diseases: with emphasis on EB virus, human herpesvirus 6 and hepatitis C virus[J]. J Dermatol Sci,2000,22(3):169-180.DOI: 10.1016/S0923-1811(99)00083-3.

[6]Wang Y, Mao S, Li B, et al. Treatment of hepatitis C virus core-positive hepatocytes with the transfer of recombinant caspase-3 using the 2’,5’-oligoadenylate synthetase gene promoter[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2009,41(7):554-560.DOI: 10.1093/abbs/gmp044.

[7]Li J, Verhaar AP, Pan Q, et al. Serum levels of caspase-cleaved cytokeratin 18 (CK18-Asp396) predict severity of liver disease in chronic hepatitis B[J]. Clin Exp Gastroenterol,2017,10:203-209.DOI: 10.2147/CEG.S135526.

[8]Shubin AV, Demidyuk IV, Lunina NA, et al. Protease 3C of hepatitis A virus induces vacuolization of lysosomal/endosomal organelles and caspase-independent cell death[J]. BMC Cell Biol,2015,16:4.DOI: 10.1186/s12860-015-0050-z.

[9]Masuoka HC, Guicciardi ME, Gores GJ. Caspase inhibitors for the treatment of hepatitis C[J]. Clin Liver Dis,2009,13(3):467-475.DOI: 10.1016/j.cld.2009.05.010.

[10]Wang Q, Na B, Ou JH, et al. Hepatitis B virus alters the antioxidant system in transgenic mice and sensitizes hepatocytes to Fas signaling[J]. PLoS One,2012,7(5):e36818.

[11]Chan CW, Chiang AK, Chan KH, et al. Epstein-Barr virus-associated infectious mononucleosis in Chinese children[J]. Pediatr Infect Dis J,2003,22(11):974-978.DOI: 10.1097/01.inf.0000095199.56025.96.