許軍　石鑫　舒暢　冷焱　曹博　孫巍

150030 哈爾濱，黑龍江省疾病預(yù)防控制中心(許軍、石鑫、舒暢、曹博、孫巍)；158100 雞西市疾病預(yù)防控制中心(冷焱)

諾如病毒(Norovirus, NoV)屬于杯狀病毒科，是引起暴發(fā)和散發(fā)性急性胃腸炎的主要致病原。諾如病毒傳播力強，可通過水、食物、氣溶膠和接觸等多種途徑傳播，主要發(fā)生在醫(yī)院、學(xué)校、幼托機構(gòu)、養(yǎng)老院等相對密閉的場所，主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉等[1]。2016年黑龍江省共報告4起急性胃腸炎暴發(fā)疫情，發(fā)病211例，無死亡病例。本研究對相關(guān)樣本進行病毒核酸檢測和序列分析，以了解這4起暴發(fā)疫情的病原分子特征，為今后此類疾病監(jiān)測和疫情處置提供參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1標本采集由疫情發(fā)生地的疾病預(yù)防控制中心進行現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，采集現(xiàn)癥患者的肛拭子或糞便標本，低溫送至黑龍江省疾病預(yù)防控制中心，-70 ℃保存待檢。

1.2病毒核酸提取用無菌生理鹽水將糞便標本制成10%懸液，振蕩每個標本1 min，置離心機2 370×g離心5 min。取上清液200 μl，采用德國Qiagen公司的RNeasy Mini Kit試劑盒進行病毒核酸提取，提取方法按照說明書進行。

表1　2016年黑龍江省4起胃腸炎暴發(fā)疫情概況

1.3熒光定量RT-PCR、RT-PCR及序列測定使用江蘇碩世NoV GI/GII熒光定量PCR檢測試劑盒檢測NoV GI、GII。選取NoV陽性標本，采用引物P290/P289擴增病毒的聚合酶區(qū)(RdRp)片段[2]；采用引物G1SKF/G1SKR、COG2F/G2SKR分別擴增GI、GII部分衣殼蛋白(VP1)片段[3]；采用引物MON432/G1SKR、MON431/G2SKR分別擴增包括GI、GII的ORF1/2重疊區(qū)基因序列[4]，進行重組分析。擴增PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送至賽默飛世爾科技公司進行雙向序列測定。

1.4序列拼接和進化分析序列拼接使用DNAStar軟件中的Seqman程序。從GenBank下載NoV GI、GII各基因型參考株序列，使用Mega6.0軟件的Clustal W進行序列比對，采用鄰接法構(gòu)建進化樹，bootstrap重復(fù)檢驗1 000次。重組分析采用SimPlot3.5.1軟件進行。

2　結(jié)果

2.1疫情概況和特征2016年黑龍江省共報告4起胃腸炎暴發(fā)疫情(表1)，其中2016年10月1起，11月2起，12月1起。疫情發(fā)生在學(xué)校、幼托機構(gòu)，其中學(xué)校2起，幼托機構(gòu)2起。共發(fā)病211例，無死亡病例。其中男性患者97例，女性患者114例，男女性別比為1∶1.2。病例最小年齡為3歲，最大為48歲。不同年齡段中，≤5歲共28例，占13.27%；6～18歲年齡組共127例，占60.19%；≥19歲共56例，占26.54%。病例病程短、病情輕，主要臨床表現(xiàn)為嘔吐(90.5%)、腹痛(71.1%)、發(fā)熱(57.8%)和腹瀉(53.6%)(表2)。

2.2序列測定及系統(tǒng)進化分析隨機選取每起疫情的陽性標本3～4份擴增NoV部分RdRp和VP1片段，進行序列測定分析，構(gòu)建進化樹，如圖1、2和表3。

表2　2016年黑龍江省4起胃腸炎暴發(fā)疫情病例臨床特征

表3　2016年黑龍江省4起胃腸炎暴發(fā)疫情諾如病毒分型結(jié)果

注：“-”表示未測出序列

Note: “-”indicates undetected sequence

“●”表示2016年黑龍江省4起暴發(fā)疫情陽性標本圖1　NoV RdRp區(qū)核苷酸序列進化分析“●”indicates stains of 4 outbreaks of gastroenteritis in Heilongjiang, 2016Fig.1　Phylogenetic tree based on partial RdRp gene sequences

2.3重組分析RdRp區(qū)和VP1區(qū)分型結(jié)果不一致的陽性株為疑似重組型。通過序列分析發(fā)現(xiàn)本研究存在疑似重組型：GII.P12/GII.3型、GI.Pd/GI.3型，重組位點需要進一步通過重組分析軟件確定。對疑似重組型用引物MON432/G1SKR、MON431/G2SKR分別擴增包括NoV GI、GII的ORF1/2重疊區(qū)基因序列，用SimPlot3.5.1軟件對序列進行重組鑒定(圖3)。選取樣本Heilongjiang-HL7、Heilongjiang-QTH1分別作為GII.P12/GII.3、GI.Pd/GI.3重組型的代表株進行重組分析。結(jié)果顯示Heilongjiang-HL7在RdRp區(qū)與GII.12/Sakai/04-179(AB220922)參考株具有高度同源性，在VP1區(qū)與GII.12/Sakai/04-179同源性降低，與GII.3/Toronto(U02030)參考株的同源性迅速增高。Heilongjiang-QTH1在RdRp區(qū)與參考株GI.Pd/Vesoul576(EF529738)具有高度同源性，在VP1區(qū)與GI.Pd/Vesoul576同源性降低，與參考株GI.3/VA98115(AY038598)同源性迅速增高。

● 表示2016年黑龍江省4起暴發(fā)疫情陽性標本圖2　NoV VP1區(qū)核苷酸序列進化分析“●”indicates stains of 4 outbreaks of gastroenteritis in Heilongjiang, 2016Fig.2　Phylogenetic tree based on partial VP1 gene sequence

圖3　重組株RdRp和VP1區(qū)基因序列Simplot分析Fig.3　Simplot analysis of partial polymerase and capsid gene sequence of the strains

3　討論

本研究在2016年黑龍江省4起急性胃腸炎暴發(fā)疫情樣本中均檢出NoV ，NoV 陽性率為34.3%(35/102)，這4起暴發(fā)疫情均發(fā)生在冬季。提示NoV 已成為我省急性胃腸炎暴發(fā)的重要病原。托幼機構(gòu)和學(xué)校是NoV 胃腸炎暴發(fā)的重要場所，主要癥狀表現(xiàn)為嘔吐。

NoV 為單股正鏈RNA病毒，分為3個開放閱讀框(ORFs)。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，ORF2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白(VP1)，ORF3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白(VP2)。根據(jù)基因特征，NoV 被分為6個基因群(Genogroup，GI-GVI)，感染人類的主要為GI、GII和GIV，GI和GII可進一步分為9個和22個基因型[5]。NoV 易發(fā)生變異，主要通過突變和重組兩個機制發(fā)生變異，這使NoV 的基因和抗原性具有豐富的多樣性。通常報道的重組主要是NoV RdRp區(qū)和VP1區(qū)屬于不同的基因型，重組位點一般位于ORFl/ORF2重疊區(qū)[6]。本研究選擇了較為保守的部分RdRp區(qū)和VP1區(qū)進行測序分析。結(jié)果顯示哈爾濱市南崗區(qū)高校疫情由GII.17型、GI.6型引起；呼蘭區(qū)幼托機構(gòu)疫情由GII.2型、GII.P12/GII.3型引起；七臺河市中學(xué)疫情由GII.Pe、GI.Pd/GI.3型引起；阿城區(qū)幼托機構(gòu)疫情由GII.2引起。

有研究顯示，在引起胃腸炎暴發(fā)的NoV 中，GII一直處于優(yōu)勢地位，其中GII.4型一直是引起人類急性胃腸炎暴發(fā)的主要基因型，其次為GII.3型。GII.3型常以基因型間重組的形式出現(xiàn)，如GII.Pa/GII.3、GII.Pb/GII.3、GII.P12/GII.3[7]。但在2014年底出現(xiàn)了一種新的GII.17變異株，并在中國(廣州[8]、北京[9])和日本[10]引起暴發(fā)流行。監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示2015年我國NoV 相關(guān)急性胃腸炎主要是由GII.17新變異株引起。本研究根據(jù)部分RdRp區(qū)和VP1區(qū)基因序列構(gòu)建的遺傳進化樹顯示，在哈爾濱市南崗區(qū)高校疫情檢測到的GII.17型與2014—2015年日本、2014年中國(廣州、香港)分離株親緣關(guān)系接近，可能為同一遺傳進化來源。新GII.17型在主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1的P2區(qū)上發(fā)生了一系列的氨基酸突變，這些位點包括病毒與宿主細胞上受體的結(jié)合位點及病毒抗原性決定域等。這些氨基酸突變很可能是導(dǎo)致病毒突然暴發(fā)流行的主要原因[11]。

在黑龍江省2016年11、12月的2起疫情中均檢測到GII.2型NoV ，并且在其中1起疫情中還檢測到GII.P12/GII.3重組型。這2起疫情的GII.2型NoV 核苷酸序列高度同源，提示NoV 在黑龍江省流行過程中不同基因型持續(xù)的共同進化和循環(huán)。我省對2012—2015年病毒性腹瀉監(jiān)測結(jié)果顯示：480例腹瀉樣本中GII.P12/GII.3重組型檢出3例、GII.4_Sydney2012型檢出3例[12]。2016年我國NoV 暴發(fā)以GII.2型為主，GII.2型是我省首次在急性胃腸炎暴發(fā)病例中檢出該基因型病毒。我國2014—2015年在安徽省[13]、廣東省[14]均發(fā)生GII.2型NoV 引起的急性胃腸炎暴發(fā)疫情。此外還在1起疫情中檢測到GI.Pd/GI.3重組型。我國由GI.Pd/GI.3重組型NoV 引起的急性胃腸炎暴發(fā)疫情在以往的文獻中報道較少，也是黑龍江省首次檢測到的GI重組型。依據(jù)目前文獻澳大利亞維多利亞州2002—2010年69起胃腸炎暴發(fā)疫情由GI引起，其中有5起是由GI.Pd/GI.3重組型NoV 引起[15]。重組可使病毒的抗原決定基因發(fā)生改變，病毒逃避宿主的免疫應(yīng)答，引起暴發(fā)或流行。黑龍江省至今還未見關(guān)于GII.2型、GI.6型、GI.Pd/GI.3重組型NoV 暴發(fā)疫情和散發(fā)病例的報道，這提示NoV 在黑龍江省存在多個基因型的流行，因此需要加強監(jiān)測，弄清來源，關(guān)注其發(fā)展，為疫情處置和科學(xué)防控提供參考數(shù)據(jù)。

利益沖突無

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