李蘭芝，程 茜，苑中策，龍 淼，何劍斌，李 鵬

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866)

隨著我國奶牛養(yǎng)殖方式向規(guī)模化和集約化飼養(yǎng)的轉(zhuǎn)變，泌乳量不斷提高的同時(shí)能量需要量也在不斷增加，由于分娩后產(chǎn)奶高峰與采食高峰存在時(shí)間差異，奶牛能量負(fù)平衡(negative energy balance,NEB)的狀況增加了近年來酮病的發(fā)病率。奶牛發(fā)生酮病時(shí)，血液中非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)和β羥基丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)含量顯著升高，造成肝臟功能損傷，引發(fā)氧化應(yīng)激，并會(huì)伴隨一系列生理代謝的紊亂。這些因素都對奶牛的免疫功能以及繁殖性能造成影響，進(jìn)而引發(fā)其他產(chǎn)后疾病。

奶牛酮病又稱奶牛醋酮血癥、酮血癥，以低血糖和高酮血癥為主要特征，是由碳水化合物和脂肪酸代謝障礙引起的奶牛產(chǎn)后全身性功能失調(diào)的營養(yǎng)代謝性疾病。常依據(jù)有無臨床表現(xiàn)分為臨床酮病和亞臨床酮病。當(dāng)血清中BHBA的濃度≥3.0 mmol/L時(shí)可確定為臨床酮病(clinical ketosis,CK)，BHBA的濃度在1.2 mmol/L～2.9 mmol/L時(shí)可確定為亞臨床酮病(subclinical ketosis,SCK)[1]，并且亞臨床酮病被認(rèn)為是其他代謝和感染性疾病如子宮炎、乳腺炎、臨床酮癥和皺胃移位的網(wǎng)關(guān)條件，且亞臨床酮病具有不容易預(yù)防和診斷等特點(diǎn)。由于其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文針對酮病對奶牛免疫功能及其機(jī)理的影響進(jìn)行論述，為臨床上酮病及其相關(guān)產(chǎn)后疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 酮病對奶牛免疫功能的影響

酮體(主要為BHBA)含量的提升會(huì)損害免疫細(xì)胞的功能，造成產(chǎn)后的感染增加，奶牛也會(huì)呈現(xiàn)抗氧化功能的下降，引發(fā)氧化應(yīng)激，這些都會(huì)造成乳房、子宮、蹄部更容易被細(xì)菌感染而發(fā)生乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎等感染性疾病。在英國、法國、德國、意大利和荷蘭的歐洲奶牛場的研究表明，酮病在年輕奶牛中非常普遍，并且與常見的產(chǎn)后疾病，如子宮炎、乳腺炎、牛乳熱、跛行、胃腸道疾病和皺胃移位等相關(guān)。圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡的壓力可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的脂肪動(dòng)員，引發(fā)循環(huán)中NEFA及酮體的過度升高。NEFA濃度的升高可降低機(jī)體的免疫力，能夠引發(fā)多種和免疫相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

Smith G L等[2]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)犢后奶牛亞臨床酮癥增加了奶牛發(fā)生皺胃移位、子宮炎、臨床酮癥、子宮內(nèi)膜炎、產(chǎn)后首次排卵時(shí)間推遲、乳腺炎嚴(yán)重性增加和早期泌乳產(chǎn)量降低等風(fēng)險(xiǎn)。Brodzki P等[3]發(fā)現(xiàn)發(fā)生子宮炎的母牛在產(chǎn)犢期間循環(huán)中性粒細(xì)胞中的糖原含量減少，此外，大腸埃希菌刺激的單核細(xì)胞中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的表達(dá)也呈下降趨勢。有研究表明外周血單核細(xì)胞的增殖與血清中NEFA和BHBA的濃度呈負(fù)相關(guān)，多種免疫細(xì)胞功能受NEFA濃度的影響。因此，在圍產(chǎn)期奶牛血液中游離脂肪酸濃度的增加可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)后免疫抑制[4]。Hillreiner M等[5]研究發(fā)現(xiàn)，血液中BHBA濃度增加可能或至少部分地導(dǎo)致了奶牛在泌乳早期乳腺炎的高敏感性，BHBA的免疫抑制作用可能歸因于免疫應(yīng)答基因的總體抑制，說明長期升高的BHBA濃度，對先天免疫應(yīng)答具有負(fù)面影響。Stefańska B等[6]發(fā)現(xiàn)亞臨床型瘤胃酸中毒存在于大量具有免疫功能受損的奶牛中。同時(shí)，有研究表明，葡萄糖利用性降低和增加的NEFA和BHBA濃度可以通過多種途徑損害機(jī)體免疫防御機(jī)制[7]。

2 酮病影響奶牛免疫功能的機(jī)制

2.1 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)氧化劑作用超過了抗氧化劑作用所導(dǎo)致的氧化劑和抗氧化劑之間的一種不平衡狀態(tài)。酮病奶牛存在氧化應(yīng)激，且高NEFA血癥和/或BHBA血癥可以引發(fā)酮病奶牛氧化應(yīng)激[8]。一些研究證實(shí)氧化應(yīng)激是一個(gè)非常重要的潛在因素，特別是在圍產(chǎn)期，能夠干擾機(jī)體的宿主免疫和炎癥反應(yīng)過程，因此增加了奶牛對各種疾病的易感性[9]。Youssef M等[10]研究也表明圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡使得奶牛遭受氧化應(yīng)激的侵害。

Li Y等[11]研究結(jié)果表明，酮病和亞臨床酮病奶牛的血漿葡萄糖水平低于非酮病牛，但血漿中NEFA和BHBA濃度較高，此外，還觀察到酮癥母牛血漿中NEFA和BHBA的濃度與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)表達(dá)水平呈正相關(guān)，與總膽固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)、維生素E水平和羥基自由基能力呈負(fù)相關(guān)，說明酮病奶牛氧化應(yīng)激可能與高酮血癥和高NEFA濃度有關(guān)。免疫細(xì)胞含有高濃度的多不飽和脂肪酸，其細(xì)胞膜對過氧化反應(yīng)非常敏感，并且當(dāng)被刺激時(shí)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，活性氧可引起脂質(zhì)過氧化，對組織細(xì)胞造成破壞。

奶牛發(fā)生酮病時(shí)，高濃度的NEFA和BHBA積聚在血液中，引起機(jī)體酸中毒，破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，影響肝細(xì)胞蛋白及代謝酶的生物學(xué)功能，對肝細(xì)胞造成“一次損傷”。具有臨床酮癥的圍產(chǎn)期奶牛，脂肪細(xì)胞中的BHBA抑制脂肪細(xì)胞的體外脂解作用，肝臟中脂肪的顯著積累阻礙了代謝并削弱了免疫反應(yīng)。同時(shí)，高濃度的NEFA和BHBA使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激的產(chǎn)物對肝細(xì)胞的細(xì)胞膜、線粒體膜、蛋白質(zhì)等造成過氧化損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞經(jīng)歷“二次損傷”。這可能是由于脂肪動(dòng)員和甘油三酯沉積在肝細(xì)胞中，導(dǎo)致肝臟損傷和功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，奶牛在圍產(chǎn)期處于免疫抑制狀態(tài)，血漿中較高濃度的3-羥基丁酸直接影響中性粒細(xì)胞的功能，發(fā)現(xiàn)奶牛產(chǎn)犢后其中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的能力增強(qiáng)，而釋放超氧化物陰離子和過氧化氫的能力受到損傷[12]。奶牛產(chǎn)犢后第1周和第2周肝臟甘油三酯(triacyl glycerol,TAG)含量的增加與源自血液和子宮的多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophilic granulocytes,PMN)的功能降低有關(guān)，且在高水平TAG條件下，血液中PMN上與功能相關(guān)的表面分子表達(dá)降低，這可以解釋為什么在產(chǎn)犢時(shí)脂肪過多(肝臟TAG含量增加)的牛具有較高的傳染病發(fā)病率。

2.2 對白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量、吞噬功能及趨化功能的影響

白細(xì)胞是乳腺組織中對致病微生物感染具有抗性的重要細(xì)胞,白細(xì)胞的吞噬和趨化性在感染部位的病原體清除中起重要作用。PMN是奶牛乳腺的初級吞噬細(xì)胞，是牛乳腺炎感染期間抵抗病原體入侵的第一道防線[13]。PMN是先天免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，約占白細(xì)胞總量的70%，以吞噬殺菌和炎癥反應(yīng)為主。酮病奶牛的特點(diǎn)是血液中高濃度的NEFA和BHBA，高濃度的NEFA和BHBA參與奶牛PMN免疫功能的調(diào)節(jié)。

免疫系統(tǒng)在子宮內(nèi)膜炎發(fā)生機(jī)制中起著主要作用，在細(xì)胞水平上，通過子宮白細(xì)胞和PMN對入侵細(xì)胞的細(xì)菌或污染物進(jìn)行防御。許多研究表明，大腸埃希菌乳腺炎的嚴(yán)重性主要由牛自身因素而不是由大腸埃希菌致病性決定，在大腸埃希菌乳腺炎期間，宿主防御狀態(tài)是決定疾病結(jié)果的主要因素。我們知道中性粒細(xì)胞是奶牛對大腸埃希菌乳房內(nèi)感染防御的關(guān)鍵因素，通過中性粒細(xì)胞有效消除病原體對于解決感染大腸埃希菌乳腺炎是重要的一步。分娩前后奶牛生理狀態(tài)的變化增加了血液中NEFA和BHBA的濃度，導(dǎo)致白細(xì)胞趨化性和吞噬作用降低。Li C等[14]通過人工誘導(dǎo)NEB發(fā)現(xiàn)，NEB奶牛血清中皮質(zhì)醇、血清白蛋白的濃度高于正常奶牛，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)NEB奶牛PMN的吞噬功能和血清淀粉樣蛋白A的濃度較正常奶牛低，其結(jié)果表明免疫細(xì)胞功能可能是葡萄糖依賴性的，進(jìn)而推測可能是由于產(chǎn)后糖皮質(zhì)激素分泌的增加而加劇了免疫抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量有減少的現(xiàn)象[15]。

在國內(nèi)有研究表明，亞臨床酮病可導(dǎo)致奶牛循環(huán)血液中白細(xì)胞、PMN及PMN趨化性和吞噬作用降低。NF-κΒ信號(hào)通路是中性粒細(xì)胞重要的炎癥應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制，張玉明[16]研究表明，酮病奶牛高濃度的NEFA(≥0.5 mmol/L)和BHBA(≥1.2 mmol/L)能夠激活NF-κΒ信號(hào)通路，促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的合成和釋放，引起奶牛PMN炎性損傷，從而導(dǎo)致酮病奶牛免疫機(jī)能低下。

國外研究也證實(shí)，隨著血液中BHBA濃度的增加(0.1 mmoL/L～8 mmoL/L),PMN對P4型大腸埃希菌的吞噬作用降低了5倍，BHBA導(dǎo)致由P4型大腸埃希菌激活的PMN細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的形成降低了10倍，并且PMN細(xì)胞外誘捕網(wǎng)對該細(xì)菌的殺菌活性也相似降低，但是不影響中性粒細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)殺菌能力，BHBA對牛中性粒細(xì)胞的這些負(fù)面影響可能解釋了酮癥母牛對乳腺炎和其他感染疾病敏感性的增加[17]。雖然其他因素也有可能降低酮病奶牛免疫系統(tǒng)的效率，但酮體可以直接影響中性粒細(xì)胞趨化性以及中性粒細(xì)胞對膠乳顆粒(1.09 μm)的吞噬作用，所以反芻動(dòng)物在“酮癥綜合征”期間感染性疾病的高發(fā)病率，也可以用酮體對中性粒細(xì)胞功能的影響來解釋[18]。

2.3 對淋巴細(xì)胞的影響

淋巴細(xì)胞也是一種白細(xì)胞，由淋巴器官產(chǎn)生，是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分。成熟的淋巴細(xì)胞在抗原刺激的分化和增殖中起到其免疫功能。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平可以反映細(xì)胞免疫的水平。

在較低葡萄糖濃度下，超生理水平的BHBA抑制淋巴細(xì)胞增值，丁酸鹽(濃度大于牛血漿中的濃度)和乙酸鹽(正常水平)抑制牛淋巴細(xì)胞增殖。國內(nèi)類似研究也表明，亞臨床酮病可以導(dǎo)致奶牛循環(huán)血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低。酮體降低了牛淋巴細(xì)胞的促有絲分裂反應(yīng)，BHBA的毒性濃度和亞毒性濃度或乙酰乙酸鹽的毒性濃度都顯著影響牛淋巴細(xì)胞的促有絲分裂反應(yīng)，當(dāng)僅用β羥基丁酸酯或乙酰乙酸酯孵育淋巴細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)有絲分裂應(yīng)答減少。Meganck V等[19]研究表明，肥育不足的奶牛其初級巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著高于正常奶牛，而過度肥育的奶牛具有更多的初級B淋巴細(xì)胞，且血清中β-羥基丁酸酯濃度與較高數(shù)量的初級T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)。

2.4 對外周血免疫球蛋白G及部分細(xì)胞因子的影響

2.4.1 對外周血免疫球蛋白G的影響 IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，占血清免疫球蛋白總含量的75%，其在結(jié)合補(bǔ)體、增強(qiáng)免疫細(xì)胞吞噬病原微生物和中和細(xì)菌毒素的能力方面，具有重要作用，能有效地抗感染。

Herr M等[20]發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期奶牛血漿中IgG的含量從整體的變化趨勢來看，出現(xiàn)了一個(gè)先下降，后恢復(fù)的過程。奶牛血漿中IgG的含量從產(chǎn)前8周就逐漸開始下降，分娩后2 d～3 d降至最低，直到產(chǎn)后第4周恢復(fù)正常水平。但也有研究表明，IgG的含量是從產(chǎn)前第4周開始下降[21]。Hillreiner M等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度酮體的存在不僅使得PMN的吞噬和殺菌能力降低，而且在酮癥牛中觀察到細(xì)菌感染后細(xì)胞因子的產(chǎn)生量下降，以及白細(xì)胞的數(shù)量和趨化能力受損。

2.4.2 對細(xì)胞因子的影響 白細(xì)胞介素-2(IL-2)是引導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增和表型發(fā)育的細(xì)胞因子,在傷口愈合中起重要作用，IL-2及其受體可能有助于傷口愈合受損型疾病的治療[23]。泌乳牛乳房內(nèi)IL-2和γ干擾素(IFN-γ)可使牛耐受性增強(qiáng)，且IL-2可激活乳中性粒細(xì)胞并增強(qiáng)其殺菌活性。Sun Feifei等[24]研究發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期酮癥奶牛血漿中IL-2濃度較低，同時(shí)，瘤胃保護(hù)性蛋氨酸和氯化膽堿可以改善這一情況。

Shi Xiaoxia等[25]研究表明，血清中高濃度的NEFA和BHBA使得奶牛肝細(xì)胞中炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平升高。Denis-Robichaud J等[26]發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子例如IL-6，IL-8和TNF-α可以加速多形核中性粒細(xì)胞在感染后浸潤到牛子宮內(nèi)膜中。Zarrin M等[27]發(fā)現(xiàn)血漿中BHBA濃度的增加上調(diào)了乳腺中的急性期蛋白。Zhang G等[28]研究發(fā)現(xiàn)，具有酮癥的奶牛血清中有較高濃度的BHBA、IL-6、TNF、血清淀粉樣蛋白A和乳酸。

細(xì)胞因子如IFN-γ或TNF在產(chǎn)生免疫原性微環(huán)境中起關(guān)鍵作用，是抗轉(zhuǎn)移性癌癥的關(guān)鍵因素[29]。IFN在免疫后期或小劑量時(shí)，對T細(xì)胞和B細(xì)胞都有促進(jìn)作用；其還可激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的活性。血液中酮體濃度的增加抑制了血液白細(xì)胞中干擾素的產(chǎn)生，有研究發(fā)現(xiàn)，亞臨床酮病奶牛血液中細(xì)胞因子IFN-γ水平呈現(xiàn)顯著下降，IL-2和IL-8也均呈現(xiàn)下降趨勢。Sundrum A等[10]用不同濃度的NEFA和BHBA刺激多形核巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，IFN-γ的分泌量隨著NEFA和BHBA的劑量的升高呈線性下降趨勢，說明酮病情況下，NEFA和BHBA濃度過高是造成IFN-γ減少的主要因素。

3 展望

綜上所述，奶牛發(fā)生酮病時(shí)，機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)、免疫細(xì)胞功能、血液抗體水平以及細(xì)胞因子水平均發(fā)生顯著改變，可能是導(dǎo)致酮病奶牛免疫功能降低，其他圍產(chǎn)期疾病患病風(fēng)險(xiǎn)增加的重要因素，但有關(guān)酮病對奶牛免疫功能影響的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。目前對奶牛發(fā)生酮病時(shí)各器官組織發(fā)生炎癥反應(yīng)的程度及差異的研究還較少，缺少針對奶牛酮病時(shí)的機(jī)體炎癥狀態(tài)、免疫功能的細(xì)胞水平和分子水平的檢測與鑒定。因此，在分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平等不同層面揭示圍產(chǎn)期奶牛物質(zhì)代謝過程及其與免疫功能之間的相互作用關(guān)系，尤其是高水平NEFA和BHBA等對奶牛免疫功能的影響及其細(xì)胞信號(hào)通路，可能是未來研究的熱點(diǎn)問題。

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