李 欣，周麗雅，柴晶美，楊阿龍

( 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117 )

自由基是具有一個(gè)以上的不成對(duì)電子的分子或原子的總稱，在機(jī)體內(nèi)的自由基主要來(lái)自生物體的代謝產(chǎn)物，也可來(lái)自環(huán)境的物理輻射和化學(xué)物質(zhì)，自由基很活潑，在機(jī)體內(nèi)有很強(qiáng)的氧化作用，自由基過(guò)多或者清除過(guò)慢，會(huì)加速機(jī)體衰老進(jìn)程并誘發(fā)多種疾病[1-3]。因此，選擇有效的抗氧化劑和自由基清除劑來(lái)預(yù)防及治療疾病具有重要意義。參景固本方由人參、紅景天、山楂等中藥組成[4]。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，以上藥材中的成分均具有一定的抗氧化能力，但其組方共同抗氧化方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文用多種方法研究參景固本方的體外抗氧化作用和清除自由基的活性,為探索參景固本方藥理作用的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 參景固本方組成：人參、紅景天、山楂（安徽易元堂中藥飲片有限公司）。DPPH、VC、無(wú)水乙醇、FeSO4、H2O2、水楊酸、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、還原型輔酶I二鈉鹽（NADH）、氯化硝基四唑氮藍(lán)（NBT）等，均為分析純。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD），電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 參景固本方的提取 將人參、紅景天及山楂等中藥材，用鼓風(fēng)機(jī)常溫風(fēng)干，用高速粉碎機(jī)將干燥藥材粉碎，過(guò)40目篩，取20 g以1:8的料液比加濃度為70%乙醇溶液提取3次，2 h/次，融合3次所得溶液，過(guò)濾，濃縮至1 mg/mL溶液，4 ℃冷藏備用。

1.2.2 清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn) 于酶標(biāo)板中加入不同濃度的藥物溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL）100 mL和0.5 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液100 mL，震蕩30 s，室溫反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定A[8]。VC為陽(yáng)性對(duì)照。清除率（%）= [1-（A1-A2）]/（A3-A4）×100%A1：不同濃度藥液100 mL＋DPPH溶液100 mL，A2：無(wú)水乙醇100 mL＋DPPH溶液100 mL，A3：不同濃度藥液100 mL＋無(wú)水乙醇100 mL，A4：無(wú)水乙醇200 mL。

1.2.3 清除羥自由基實(shí)驗(yàn)[9]在50 mL比色管中依次加入2 mmol/L FeSO43 mL，1 mmol/L H2O23 mL，搖勻，再加入6 mmol/L 水楊酸 3 mL，搖勻，在37 ℃水浴中加熱15 min后測(cè)其吸光度D1，然后分別加入一定濃度的藥液（0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，1 mg/mL），再分別加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，在37 ℃水浴鍋中加熱15 min后測(cè)其吸光度D2。VC為陽(yáng)性對(duì)照。清除率（%）=（D1-D2）/D1×100%。

1.2.4 清除超氧陰離子實(shí)驗(yàn)[10]于酶標(biāo)板中加入不同濃度溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL）50 mL，再依次加入150 mL PMS溶液50 mL，1.2 mmol/L NADH溶液50 mL，360 mmol/L NBT溶液50 mL，震蕩30 s，室溫反應(yīng)5 min，在波長(zhǎng)540處測(cè)定。VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參景固本方清除DPPH自由基能力 由圖1可見(jiàn)，參景固本方對(duì)DPPH自由基有明顯的清除作用，清除能力隨濃度增加而增加，在濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)71.18%；加入量相同時(shí)，清除能力隨時(shí)間的延伸先快速上升后趨于平緩，在反應(yīng)30 min時(shí)，各藥液的清除率均趨于最大數(shù)值。結(jié)果提示，參景固本方對(duì)DPPH自由基有明顯的清除能力，但其作用低于VC的清除能力。

圖1 參景固本方清除DPPH自由基能力隨濃度變化情況

2.2 參景固本方清除羥自由基能力 由圖2可見(jiàn)，參景固本方對(duì)羥自由基的清除作用在濃度為0.2～0.6 mg/mL時(shí)線性增加趨于平緩，隨后增加趨勢(shì)強(qiáng)烈，整個(gè)過(guò)程清除率呈上升狀態(tài)，在濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)66.58%。結(jié)果提示，參景固本方對(duì)羥自由基有一定的清除作用，但其清除作用略低于VC。

圖2 參景固本方清除羥自由基能力

2.3 參景固本方 清除超氧陰離子能力 參景固本方對(duì)超氧陰離子的清除率隨濃度的增加，線性增加遲緩，但整體呈上升狀態(tài)，藥液濃度在1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)36.59%，濃度在0.6～1 mg/mL之間時(shí)其清除率明顯低于VC。結(jié)果提示，參景固本方有清除超氧陰離子作用，但與VC相比略有劣勢(shì)。

3 小結(jié)

在生物體內(nèi)超氧陰離子自由基作為所有氧自由基中的基礎(chǔ)，可通過(guò)復(fù)雜反應(yīng)生成其他種類自由基，從而引起脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能改變[11]。這種損害最易見(jiàn)于多種代謝較活躍的器官的細(xì)胞線粒體中，導(dǎo)致這些器官老化，從而發(fā)生記憶力減退、心血管疾病、尿毒癥等老年性疾病。這些自由基性質(zhì)很活潑，在機(jī)體內(nèi)由很強(qiáng)的氧化能力，并且極易產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，對(duì)核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等造成傷害后，在機(jī)體內(nèi)結(jié)成色素斑，加速了衰老進(jìn)程。因此，尋求自然成分的抗氧化劑成為時(shí)下研究的熱點(diǎn)。

研究表明，紅景天、人參、山楂均有明顯的自由基清除能力及抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，參景固本方對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均有不同程度的清除作用，說(shuō)明具有一定的抗氧化作用，在濃度為1 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率達(dá)到了71.18%、66.58%、36.59%，雖沒(méi)有對(duì)照組效果顯著，但參景固本方還有更多的生物學(xué)活性，如抗衰老、降脂、消食等作用，仍具有很好的應(yīng)用價(jià)值，為今后的研究開(kāi)發(fā)指明了更好的研究方向。

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