馬紀，王劍松，顏汝平，王海峰

（昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科一病區(qū)，云南　昆明　650101）

從上個世紀后半期以來，在全球范圍內惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率均呈顯著上升趨勢，尤其在60、70年代后，癌癥發(fā)病數(shù)以年均3%～5%的速度增長，成為了人類死亡的主要原因之一。根據WHO提供的數(shù)據，大約每年有1 000萬被新診斷為惡性腫瘤患者，并且其中絕大部分出現(xiàn)在發(fā)展中國家。我國自改革開放以來，社會、經濟、環(huán)境以及生活方式發(fā)生了很大的改變，老齡化程度越發(fā)嚴重。目前，我國已成為惡性腫瘤新發(fā)病例最多的國家之一，這必將對經濟、社會以及家庭產生重要影響。腫瘤防治已成為重要的公共健康問題。因此惡性腫瘤的研究也已成為醫(yī)學研究的熱點。通過近年來的不斷努力，研究方法以及相關研究設備的改進，對惡性腫瘤研究已經取得了一定的進展。但是惡性腫瘤的研究面臨著腫瘤標本等研究資料的相對匱乏，可重復性弱，研究進程較慢等。研究人員可以通過腫瘤組織、血液、尿液等相關標本，進行相關的實驗室研究，譬如腫瘤發(fā)病機制、特異性抗原篩選，靶向藥物研發(fā)等，從而獲得大量的信息。然而各大醫(yī)療機構在臨床工作中產生的大量腫瘤標本由于缺乏系統(tǒng)地收集管理，對實驗室研究而言珍貴的研究素材—腫瘤標本白白浪費。如何將珍貴而有限的人類惡性腫瘤資源收集并將其充分利用于腫瘤的研究，人們找到了科學合理的解決方法。

從二十世紀末期開始，歐美等發(fā)達國家興起了標準化腫瘤標本庫的創(chuàng)建，例如奧地利基因組織庫建立于1983年，目前已儲存百萬例病變或者正常的組織，美國MD癌癥中心較早建立了頭頸外科腫瘤標本庫和胰腺腫瘤組織庫[1]，儲存相關惡性腫瘤標本、癌旁組織、正常組織達萬例；2000年，華盛頓大學醫(yī)學中心等研究機構成立了前列腺癌合作單位，收集了數(shù)千例前列腺癌標本[2]。國內最早開始進行腫瘤標本庫建設的機構是北京大學臨床腫瘤學院，于1996年建庫，收集了常見普外科腫瘤組織、腫瘤患者血清標本等[3]。目前國內外各大高校與科研機構，先后建立起了多病種的腫瘤組織庫或側重于某一研究領域專門的標本庫，并予以配套了相關的采集、保存、日常管理以及臨床流行病學等資料收集的規(guī)范[4-6]。對于相關標本庫的創(chuàng)建、管理、維護、使用等相關問題。我們做了一些相應的資料進行收集、研究和分析，現(xiàn)綜述如下。

1　收集前注意事項

根據醫(yī)學倫理學要求的人體組織相關的科學研究的規(guī)范，應當對患者及家屬告知情況，征得同意：需在術中切取標本，并簽署術中留取標本協(xié)議書。術前與病理科協(xié)商，在保證病理檢查前提下，收集少量組織入標本庫儲存，標本體積較小或難以分辨時應當立即放棄。無論是收集或是使用標本，都應當獲取倫理委員會批準[3]。

2　場地、設備、信息管理系統(tǒng)及相關規(guī)程

腫瘤組織標本庫的建立和管理需要醫(yī)院相關管理部門、臨床科室、病理科及實驗室的協(xié)助和參與，應當有科學合理的建庫條件，且合理布局。在醫(yī)院手術室設立標本采樣間，包括組織取材的工具如，手術刀、精細剪、鑷子、無菌手套等，為保證取材流程無菌狀態(tài)，取材工具應當常規(guī)消毒，并進行相應包裝保存。血液標本采集裝備：離心管、吸管、采血管、保存盒等。臨時運輸保存設備：如小容量液氮罐；在實驗室設有專業(yè)的庫房，應當合理布局：大型液氮罐、-80℃超低溫冰箱，并連接溫度監(jiān)控報警系統(tǒng)。制定相應的應急預案，需專門的管理人員負責庫房管理，如遇停電等能及時將標本轉移出超低溫冰箱至液氮罐；對火災及其他突發(fā)情況也應有相應應急預案。對標本后期研究及質量控制管理，還需要專業(yè)設備儀器，如：紫外分光光度計、電泳儀、高速離心機、基因擴增儀及其滅菌設備等[3]。相應管理工作還需配備相應的電腦、打印機、相機等。日常管理：工作人員出入采樣間或庫房須佩戴一次性口罩帽子，穿隔離衣，采集標本時應當遵守手術室無菌操作原則，所有器械和凍存管使用前應當消毒，避免對標本組織產生干擾。標本的儲存應當分為多份，避免反復凍融，影響標本質量。信息管理系統(tǒng)：標本庫的管理系統(tǒng)與醫(yī)院臨床、病理、影像科室及實驗室系統(tǒng)進行一定程度信息共享，并且制定相關的臨床科室、倫理委員會的申請查詢、審批制度。制定標準操作規(guī)程：醫(yī)院臨床工作流程中增加相應的與標本庫建設相關的流程：如相應手術術后常規(guī)按規(guī)程采集標本，入庫、登記等。

3　標本的采集與保存

制定嚴格的操作規(guī)范：手術室內配備專人進行腫瘤標本采集，并且制定相關的操作規(guī)范，技術要求。

3.1腫瘤標本組織的收集[7]首先腫瘤的離體與收集應當在相應的無菌環(huán)境中進行，術中由外科醫(yī)生切除腫瘤組織及相關器官后，采集者應當確定腫瘤組織、腫瘤旁組織和切緣遠端非腫瘤組織的區(qū)分。比如取材時應注意腫瘤組織的數(shù)目、大小、形態(tài)、顏色、硬度，明確區(qū)分腫瘤組織與非腫瘤組織，保證取材質量；并且保證標本采集后的殘存組織能夠不影響術后病理診斷，避免不必要的醫(yī)療糾紛，腫瘤組織體積明顯較小則不宜取。若腫瘤標本符合取材條件，則應適當分離腫瘤與腫瘤旁組織，并測量其大小，照片存檔[8]；使用專門手術器械（應嚴格消毒）分別切取腫瘤組織、腫瘤旁組織（距離腫瘤組織2 cm的組織）和切緣遠端非腫瘤組織（距離腫瘤組織＞5 cm的組織）各數(shù)份。切取的腫瘤組織塊大小一般為：0.3～0.5 ml，切取數(shù)塊，有利于減少凍溶循環(huán)頻率且冷凍速度快[9]?？焖俜诸惡螅b入凍存管內，標本的保存首先根據科研機構及醫(yī)院各個課題組的要求條件保存，例如：冰凍標本則直接轉入液氮罐或-80℃冰箱內。石蠟標本[10]則予以10%福爾馬林固定后，進行石蠟包埋。腫瘤組織在離體后一段時間內會有因缺血原因造成的mRNA降解，對其蛋白質的表達和磷酸化水平會有一定程度的影響[11]。目前普遍認可的觀點是采集并轉運過程時間應當保證在腫瘤標本或者該器官組織切除離體后15 min內（最長不應當超過半小時）[12]，也有學者建議離體2 h內的標本也可收集。日常實踐時，由于手術相關情況，組織血供已斷，缺血時未能及時取出標本，或術后需將完整標本照相或給家屬看等，未能在規(guī)定時間取出標本，因此也會造成部分標本質量下降。為了增加腫瘤標本收集效率，標本切除后2 h以內的標本通常也有收集。收集后應記錄標本相關信息，如：標本離體時間，存入凍存管編號，標本種類，器官或組織類型，液氮罐或超低溫冰箱內擺放位置。

3.2其他標本的收集

（1）尿液：取得病人及其家屬的同意后，用開口較大容器收集（容量一般大于20 ml）。建議采集中段尿，并且應當避免陰道分泌物、月經等污染，加入甲醛或甲苯等防腐劑后，冷藏于4℃冰箱內。具體采集有：①隨機尿：較適合細胞性研究；②晨尿：比較適合檢測尿液中白細胞、紅細胞等濃縮物質。

（2）血液標本：對于入院治療患者（手術、化療、放療）可以將抽血時間分為數(shù)次：入院后第1天抽血、治療后當天、術后不同時段等。采集數(shù)量一般為5～10 ml，血樣分成兩份標本：一份不抗凝，離心后，吸取上層血清，按照一定規(guī)格分裝，最后置入-80℃冰箱或液氮罐中（多作蛋白質相關研究）；另一份加入抗凝劑及淋巴細胞分離液，后離心分離有核細胞，抽取后置無菌Ep管中（可做DNA、RNA提取及其它相關研究），向其中加入RNAlater保存液，分裝后同樣置入-80℃冰箱或液氮罐。存入的標本行相關信息采集，做好登記，避免抽取血液標本后等待時間過長，細胞mRNA、蛋白質降解，應當在采血后快速保存。

4　標本的質控與抽查

標本采集、運輸、使用過程中可能由于操作不當或者因為標本本身成分混雜，壞死、炎性組織太多，需要的腫瘤組織過少或者保存中設備異常或使用不當，導致標本質量下降。質量控制是指在腫瘤標本庫日常運行過程中，在采集，轉運，保存、信息記錄、儀器設備檢查維護等相關流程里，規(guī)范操作，且控制組織樣本質量，剔除其中不合格樣品，為了使其能夠較好地應用于實驗室研究。對于腫瘤組織、血液等標本要避其DNA、RNA和蛋白的降解，保證其質量合格，因此應當在日常管理流程中制定有利于標本檢測的制度，首先是建立標本使用者的信息反饋制度，根據其使用情況，對標本的質量有一定程度的了解，其次在收集標本組織（腫瘤、癌旁組織）時應當同時收集多份，在其中存留1～2份已被后期質量控制分析使用。研究表明DNA不易降解，質控的難點在于RNA的保存，對腫瘤標本庫內標本進行定期隨機抽樣調查，主要是針對RNA，具體操作簡述為[12-13]：對抽樣標本的備用份行總RNA進行提取，并對其予以紫外分光光度計分析，分析結果若A260/A280＞1.6，后行1%瓊脂糖凝膠電泳，如若可見28 s和18 s條帶，且前者的亮度能夠達到是后者的1～2倍，則表明腫瘤組織RNA未被降解，其質量合格并可以運用于實驗研究。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤標本采集時間對樣本RNA質量和完整性存在著較大影響，腫瘤組織離體時間越短，采集后組織RNA的降解越少，其保存完整性越高。

5　　構建病例隨訪平臺

與患者溝通，取得其同意后，將其納入隨訪平臺中，對應每一個采集的標本的患者，針對其病情制定與之相匹配的隨訪方案，目的在于可以為一些前瞻性臨床研究留下相關資料，便于觀察患者疾病的發(fā)生、進展等?？梢詫颊邉討B(tài)管理，且臨床資料能夠動態(tài)收集。對于該平臺數(shù)據錄入方面，應當包括患者的一般信息（姓名、年齡、性別、聯(lián)系方式、家庭住址、住院時間、住院號等）、臨床資料（包括臨床診斷、病理、影像資料、相關病例、病程資料等）、隨訪記錄、術后恢復情況、并發(fā)疾病情況、術后復發(fā)及疾病進展情況、死亡原因和死亡日期等。

6　標本信息庫運作流程

惡性腫瘤標本庫的建立比較重要的一個環(huán)節(jié)是建立一個與之匹配信息管理系統(tǒng)，可以滿足標本庫日常運作所需的信息錄入、儲存、查詢等功能，若條件允許，則應與醫(yī)院及實驗室相關數(shù)據庫相關聯(lián)，能夠進行臨床病理、影像學資料、實驗室相關數(shù)據的鏈接。具體操作如下：首先是患者一般信息及臨床資料的錄入[14]：姓名、性別、年齡、出生地、住院號、臨床診斷等；腫瘤標本信息錄入：包括入庫編號、收集時間、入庫時間、標本類型、取材器官、凍存方法等；標本存放信息：相應的液氮罐或-80℃超低溫冰箱編號、存放架編號、存放坐標、凍存管規(guī)格型號、標本數(shù)量等；標本使用管理[15]：出庫時間、使用相關課題或用途、使用者、使用數(shù)量、出庫辦理人員等；標本廢除信息：入庫編號、存放架編號、廢除日期及其廢除原因；信息查詢功能：包括數(shù)據導入、導出、查詢、統(tǒng)計等；出庫登記：管理人員嚴格按照標本庫制定的標本入、出庫程序進行標準化管理，標本使用需申請，經醫(yī)院主管人員和腫瘤庫負責人審批后行標本出庫登記。

7　標本庫相關倫理法律問題

患者是腫瘤組織的所有者，標本庫的建立設計了活體組織的收集、保存和使用涉及到倫理學及法律的部分問題，《侵權責任法》規(guī)定，應當保證患者的知情權和自主權，因此在收集標本前應簽署相關文書，并且保證患者在收集、保存、使用、信息采集的過程中有撤銷同意的權利。使用時應當進行相應單位的審批程序，并且在此過程中保護患者隱私，維護其利益。也有一些研究機構認為患者捐獻標本有一定商業(yè)價值，應當予以。而且對標本使用嚴格把關，相關研究應當是正當?shù)目茖W研究，有利于大眾，符合倫理學要求。

8　結語及展望

隨著人口老齡化的不斷發(fā)展，腫瘤的高發(fā)，其研究成為醫(yī)學的熱點和重點。雖然近幾十年來，隨著研究相關設備的不斷改進，研究方法的不斷創(chuàng)新，腫瘤相關研究已經有了較快發(fā)展和比較豐碩的成果。此時作為惡性腫瘤研究材料的腫瘤組織標本在促進腫瘤研究進展過程中就扮演了重要的角色，成為了腫瘤研究工作的重要支撐。腫瘤組織標本庫的建立為研究提供高質量標本，一定程度上解決研究的重復性較差，研究周期長，進程較慢的問題；目前腫瘤標本庫的建立及管理尚處于起步階段，還有許多不足之處：①與國外大型腫瘤標本庫相比，國內的明顯規(guī)模較小，且缺乏統(tǒng)一管理和信息互通；②對于建立兒童腫瘤標本庫的報道甚少，標本庫數(shù)據源獨立，尚未提供與醫(yī)院病案信息系統(tǒng)、實驗室檢查、影像學檢查信息系統(tǒng)等的數(shù)據接口；③信息化滯后，無法形成各大醫(yī)院、科研機構之間大數(shù)據共享，有賴于醫(yī)院信息管理水平的提高，加大對腫瘤標本庫的重視度，以及各單位、地區(qū)之間的進一步協(xié)作。

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