吳 蔚

福建省南平市動物疫病預(yù)防控制中心 福建南平 353000

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（豬藍(lán)耳病），是以母豬繁殖障礙和仔豬嚴(yán)重的呼吸道癥狀及高死亡率為特征的豬病毒性傳染病。是我國法定的二類動物疫病[1]。無論是高致病性豬藍(lán)耳病還是經(jīng)典豬藍(lán)耳病，目前，我國普遍采用疫苗免疫的手段[2-3]。因此，做好免疫后的血清學(xué)抗體監(jiān)測就顯得十分必要。然而在基層獸醫(yī)試驗中，主要是時間及條件的限制，往往會遇到血清需要反復(fù)凍融的情況。本文基于基層獸醫(yī)試驗的需要，研究血清反復(fù)凍融對豬藍(lán)耳病抗體效價的影響。

1　材料與方法

1.1樣本與試劑 待檢測豬藍(lán)耳病抗體的血清、豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒（法國LSI）。

1.2主要儀器設(shè)備 冰箱（4℃）及冰柜（-20℃）、酶標(biāo)儀、微量移液器、恒溫生化培養(yǎng)箱、純水儀。

1.3試驗方法

1.3.1待檢血清的篩查 將剛采集的豬全血析出血清，使用間接ELISA法對豬血清進行初篩，選取其中不同抗體水平的22份陽性血清（經(jīng)病原學(xué)檢測為豬藍(lán)耳病病毒熒光RT-PCR陰性）進行試驗，并記錄下初篩時22份陽性血清的IRPC值。

1.3.2試驗血清的反復(fù)凍融 將由1.3.1初步篩查選出的22份不同抗體水平的陽性血清樣品編號后（1至22號）進行分裝，每一份血清分裝成6份，分別進行1次、2次、3次、4次、5次凍融以及不凍融操作，具體方法為：（以樣本1為例）將樣本1用離心管分裝成6份，每份樣本100 μL。第1份標(biāo)記1-1，第2份標(biāo)記1-2，以此類推，標(biāo)記至1-5，未凍融處理的樣本標(biāo)記1-0，然后將這6份樣本全部放入冰柜（-20℃）保存1 d。第2 d取出樣本1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜 （-20℃）保存。第3 d取出樣本1-4和1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜（-20℃）保存。第4 d取出樣本1-3、1-4和1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜（-20℃）保存。第5 d取出樣本1-2、1-3、1-4和1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜（-20℃）保存。第6 d取出樣本 1-1、1-2、1-3、1-4 和 1-5，放至室溫，待離心管內(nèi)血清全部融解后再放入冰柜（-20℃）保存。至此，完成樣本1的反復(fù)凍融。樣本2至樣本22，參照樣本1的凍融方法進行。所有樣本均同步進行反復(fù)凍融。凍融次數(shù)相同的樣本合裝1小袋，每袋22個樣本，共6小袋。并在袋上用記號筆做好標(biāo)記。完成樣本的反復(fù)凍融后，所有樣本均放置冰柜（-20℃）保存3個月。由于最后所有樣本均放置冰柜（-20℃）保存3個月，也算是反復(fù)凍融，故所有樣本在之前反復(fù)凍融次數(shù)上增加1次。22份樣本的凍融次數(shù)均為凍融1次、2次、3次、4次、5次及6次。

1.3.3反復(fù)凍融后樣本的抗體檢測 采用豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒進行反復(fù)凍融6次的22份樣本進行間接ELISA法檢測。檢測其OD450nm值。最終將其換算為IRPC值。

1.3.4方差分析 對以上樣本試驗后的IRPC值用軟件SPSS 17.0進行方差分析。

2　試驗結(jié)果

2.1樣本初篩時IRPC值 試驗所選取的22份樣本初篩時其IRPC值均＞20，為豬藍(lán)耳病抗體陽性，并呈現(xiàn)不同抗體水平，有弱陽性及強陽性之分，見表1。

2.2不同凍融次數(shù)測得的22份樣本IRPC值 不同凍融次數(shù)所測得的22份樣本IRPC值見表2。經(jīng)不同凍融次數(shù)以及較長時間冷凍 （-20℃，3個月），22份樣本的IRPC值均＞20，說明該批樣本仍能測出抗體陽性，并且如初測時一樣呈現(xiàn)不同抗體水平。

2.3方差分析結(jié)果 用軟件SPSS 17.0對表1-表2數(shù)據(jù)進行方差分析，得到方差分析統(tǒng)計結(jié)果，見表3。 F=0.782，P（sig）=0.585＞0.05，無顯著差異。

表3　IRPC值方差分析結(jié)果

3　分析與討論

該試驗是結(jié)合南平市春季動物防疫集中監(jiān)測時進行的，所選取的樣本為在不同規(guī)模場不同抗體水平的豬血清。在研究不同凍融次數(shù)對抗體水平的影響時，同步做了對應(yīng)豬鼻腔拭子（22個樣本）的熒光RT-PCR試驗，檢測結(jié)果均為陰性。試驗均由同一人在同一環(huán)境下操作，并且在酶標(biāo)板上分布血清樣本時，遵循同一個樣本分布在同一塊酶標(biāo)板上的原則，這樣做能盡量避免出現(xiàn)需要板間校正的情況。

試驗時特別選取無溶血的22個血清樣本。但是在動物疫病防控日常監(jiān)測中，樣本從養(yǎng)殖場（戶）到實驗室的各個環(huán)節(jié)，出現(xiàn)溶血樣本是比較常見的（尤其是禽血清）。由于條件所限，該試驗無法研究溶血等因素對血清抗體效價的影響，待試驗條件成熟后再進一步研究。但大量研究資料表明，溶血對檢測結(jié)果有影響[4]。如隆維東等[5]對30例標(biāo)本分別在溶血前及溶血后采用全自動血細(xì)胞分析儀進行血常規(guī)檢測，對比溶血前后血常規(guī)14項檢測指標(biāo)的差異發(fā)現(xiàn)，溶血標(biāo)本對血常規(guī)多個項目均有干擾。表1和表2的試驗結(jié)果說明，經(jīng)過3個月的低溫（-20℃）凍存后，血清樣本在保存完好的情況下，仍能在血清中測出抗體，而且大部分抗體仍舊保持較高的效價。

試驗結(jié)果說明，經(jīng)過反復(fù)凍融的血清樣本，其IPRC值并無統(tǒng)計學(xué)差異。即經(jīng)過1次、2次、3次、4次、5次和6次反復(fù)凍融對血清樣本的抗體效價并無太大影響。這與鐘錦輝等[6]研究血清凍融次數(shù)對豬瘟抗體效價影響的結(jié)果大體一致。試驗中只研究不超過6次反復(fù)凍融對豬藍(lán)耳病抗體效價的影響，是基于基層獸醫(yī)實驗室在日常監(jiān)測中的實際操作，而人醫(yī)資料表明，多次反復(fù)凍融對血清中某些指標(biāo)有較大影響[7]。因此，建議在檢測抗體實際操作中，血清標(biāo)本如需保存多次使用，還是少量分裝凍存為宜。

參考文獻：

[1]田克恭.高致病性豬藍(lán)耳病流行現(xiàn)狀與免疫防控進展[J].中國豬業(yè),2010(6):9-11.

表1　樣本初篩時IRPC值

表2　不同凍融次數(shù)樣本IRPC值

[2]劉訓(xùn)山.經(jīng)典豬藍(lán)耳病與高致病性豬藍(lán)耳病的臨床區(qū)別及防控措施[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011(5):334-338.

[3]李園園.高致病性豬藍(lán)耳病的發(fā)病特征及綜合防控措施[J].河南畜牧獸醫(yī),2011,32(11):28-29.

[4]汪建國.溶血、脂濁標(biāo)本對ELISA法檢測HBsAg結(jié)果的影響[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué),2009,21(8):818-819.

[5]隆維東,劉萬彬,李堅.標(biāo)本溶血對血常規(guī)檢測結(jié)果的影響分析[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,33(9):1127-1129.

[6]鐘錦輝,張海明,段曉冬,等.血清凍融次數(shù)對豬瘟抗體效價的影響[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2013,38(1):17-19.

[7]傅慧平,劉文俊.血清冷凍保存對生化檢測結(jié)果的穩(wěn)定性研究[J].中國臨床研究,2009(1):1.