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(金陵科技學(xué)院食品科學(xué)系,江蘇南京 210038)

鴿肉不僅具有豐富的營養(yǎng)價值,而且對人體有良好的保健功能。鴿肉中含有較多的支鏈氨基酸和精氨酸,可促進體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,加快創(chuàng)傷愈合[1]。肉鴿養(yǎng)殖業(yè)曾是農(nóng)民增收致富的好途徑,但經(jīng)過近十幾年肉鴿養(yǎng)殖的發(fā)展,我國的肉鴿養(yǎng)殖業(yè)進入了瓶頸時期,其中一個主要的問題是肉鴿深加工程度及其技術(shù)含量不夠,難以創(chuàng)造更高的產(chǎn)品價值,也難以具備較高的抵抗養(yǎng)殖市場風(fēng)險的能力。目前,肉鴿的銷售以農(nóng)貿(mào)市場肉鴿胴體和酒店的餐飲菜肴為主,而少量的深加工也僅是以肉鴿軟包裝罐頭為主[2]。消費者食用肉鴿一方面是因為可以享受傳統(tǒng)菜肴風(fēng)味,另一個是肉鴿還提供了一定的保健功能。但傳統(tǒng)的加工產(chǎn)品攜帶不便,以肉鴿為原料酶解獲得的氨基酸液中氨基酸種類豐富,必需氨基酸占總氨基酸的比例達到42%[3],并且藥用氨基酸含量高,以鴿肉水解液進行后續(xù)氨基酸口服液加工可以大大提高產(chǎn)品附加值,延伸肉鴿養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)鏈。

采用酶解技術(shù)進行肉制品深加工的報道很多,但應(yīng)用在鴿肉加工方面的研究較少,曾哲霖等人利用風(fēng)味蛋白酶催化水解鴿肉制備了鴿肉寡肽,寡肽濃度為0.056 g/mL[4]。周劍忠等人以乳鴿脯肉為原料,選擇復(fù)合蛋白酶(Protamex)和復(fù)合風(fēng)味酶(Flavourzyme)進行了鴿肉水解液的制備,單一酶解液水解度為25%左右[5]。關(guān)于水解液抗氧化活性報道主要集中在水產(chǎn)原料水解液的抗氧化活性研究,如劉姝等人對太平洋牡蠣水解液的抗氧化活性進行了研究[6],龔志強等人對金槍魚碎肉水解液抗氧化活性進行了研究[7]。此外,陳盛楠等人還對花生粕酶解液的抗氧化性進行了研究[8]。雖然關(guān)于水解液抗氧化活性的研究不少,但關(guān)于鴿肉水解液的抗氧化活性研究的報道尚未查見。本研究采用酶解技術(shù)進行無公害乳鴿肉精深加工技術(shù)的研究,以水解度為指標,從堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中篩選出對鴿肉蛋白水解效果較好的蛋白酶,通過單因素實驗和正交實驗進行水解工藝的優(yōu)化,確定水解鴿肉的最佳工藝條件,并對水解液進行了體外抗氧化性能的研究。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

乳鴿肉(胸脯肉)南京東溝鴿業(yè)有限公司提供;木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶購自南京都萊生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為市售,分析純。

A-88組織搗碎機常州金南儀器制造有限公司;FA1204B電子天平上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;SPX-150BSH-Ⅱ培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;MX-9渦旋振蕩器大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司;DHG-9073BS-Ⅲ干燥箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;H2050臺式高速冷凍離心機湖南湘儀離心機儀器有限公司;K9840凱氏定氮裝置濟南海能儀器股份有限公司;PHS-3C酸度計上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;85-1磁力攪拌器常州潤華電器有限公司;Alpha-1860紫外可見分光光度計上海譜元儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1鴿肉酶解液制備參考文獻[9]并進行適當修改。鴿肉洗凈→按比例加水(水面剛好沒過鴿肉)→勻漿→調(diào)節(jié)pH→加入蛋白酶→保溫酶解→90 ℃滅酶10 min→離心(4000 r/min,4 ℃,15 min)→取上清得到鴿肉酶解液。

1.2.2鴿肉酶解單一酶的選擇采用堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶四種蛋白酶分別對原料鴿脯肉進行水解,加酶量均為600 U/g原料,分別在pH7.0,55 ℃、pH7.5,60 ℃、pH7.0,65 ℃、pH7.0,55 ℃條件下保溫酶解 2 h,以水解度為指標,比較不同蛋白酶對鴿肉的水解效果,從中選擇水解效果佳的單一蛋白酶。

1.2.3鴿肉酶解液水解工藝優(yōu)化

1.2.3.1單因素實驗采用1.2.1方法水解得到鴿肉酶解液。水解條件為:固定水解時間為2 h,加酶量為600 U/g原料,考察不同反應(yīng)溫度(45、50、55、60、65 ℃)對水解度的影響;固定水解時間為2 h,水解溫度為55 ℃,考察不同加酶量(400、500、600、700、800 U/g原料)對水解度的影響;固定加酶量為600 U/g,水解溫度為55 ℃,考察不同水解時間(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)對水解度的影響,上述各實驗均重復(fù)三次,考察各因素變量對水解度的影響。

1.2.3.2正交實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上,每個因素選取三個水平,建立三因素三水平正交實驗,因素水平表見表1。

表1　正交實驗設(shè)計因素水平表Table 1　Factors and their coded levels in orthogonal test

1.2.4總氮含量的測定采用凱氏定氮法[10]。

1.2.5總氨基酸態(tài)氮含量的測定采用電位滴定法[11]。

1.2.6水解度的計算公式參見文獻[5]。

1.2.7鴿肉酶解液體外抗氧化能力的測定

1.2.7.1鴿肉酶解液還原能力的測定采用鐵氰化鉀還原法,參考文獻[12]并作適當修改:取鴿肉酶解液或抗壞血酸溶液2 mL,加入0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖溶液2 mL,1%鐵氰化鉀溶液2 mL,在50 ℃水浴中保溫20 min后放置于預(yù)先準備好的冰水混合物中急速冷卻,加入10%三氯乙酸2 mL,6000 r/min條件下離心10 min,取上清液4 mL,加水3.2 mL,0.1%氯化鐵溶液0.8 mL,混勻,靜置10 min,在700 nm處測其吸光值。

1.2.7.2鴿肉酶解液對DPPH·清除能力的測定采用文獻方法測定[13]。取超純水3 mL以及0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液3 mL在暗處靜置30 min,用分光光度計在517 nm處測其吸光值,記為A0。將各個濃度的鴿肉酶解液或抗壞血酸溶液替換超純水重復(fù)上述操作,測其吸光值,記為A1,DPPH自由基清除率計算公式如下所示。

1.2.7.4鴿肉酶解液對羥自由基(·OH)清除能力的測定采用Fenton體系·OH清除法,參考文獻[15]并做適當改動:取 0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖溶液1 mL,0.52 mg/mL番紅溶液0.2 mL,0.2 mol/L EDTA二鈉溶液0.5 mL,0.2 mol/L FeSO4溶液0.5 mL,不同濃度的樣品溶液(鴿肉酶解液或抗壞血酸溶液)7 mL,最后加入0.3%H2O20.8 mL,混勻,在40 ℃水浴鍋里保溫30 min,測定520 nm處的吸光值,記為A1。用超純水代替雙氧水重復(fù)同樣上述操作測定吸光值,記為A2,用超純水代替樣品溶液同樣重復(fù)上述操作測定吸光值,記為A0,羥自由基(·OH)清除率公式如下所示。

1.2.8數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準偏差的形式表示,數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistics 22軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1　單一蛋白酶的鴿肉水解效果

由圖1可知,風(fēng)味蛋白酶酶解效果與其它蛋白酶水解效果差異顯著,且水解度最高。因此選出效果較好的風(fēng)味蛋白酶進行水解效果單因素研究。

圖1　單一蛋白酶對鴿肉的水解效果Fig.1　The hydrolysis efficiency of different single proteinase 注:不同小寫字母表示實驗組間結(jié)果具有顯著性差異,p<0.05。

2.2　蛋白酶水解鴿肉工藝的優(yōu)化

2.2.1蛋白酶水解鴿肉工藝單因素實驗結(jié)果風(fēng)味蛋白酶水解效果的單因素結(jié)果如圖2所示。由圖2A可以看出:水解溫度上升,水解度略微提高,溫度超高55 ℃后,水解度開始下降,這是由于溫度高,酶活性受到破壞所致。由圖2B可以得知:隨著加酶量的增加,水解度逐漸上升,達到700 U/g原料后,水解度增加幅度較小,開始趨于平緩,這是由于雖然提高了加酶量,但是底物濃度基本一定,因此水解度在達到最大值后會基本保持不變。由圖2C可知:水解時間達到2.5 h后,水解度略有下降并趨于平緩,這很有可能也是和一定溫度下長時間酶活力下降有關(guān)。根據(jù)上述結(jié)果確定溫度50、55、60 ℃,加酶量600、700、800 U/g原料,水解時間2、2.5、3 h作為下一步工藝優(yōu)化正交實驗的水平。

圖2　風(fēng)味蛋白酶水解效果單因素實驗Fig.2　The single facter experiment hydrolysis efficiency of flavor protease

2.2.2蛋白酶水解鴿肉工藝正交實驗結(jié)果風(fēng)味蛋白酶水解效果的正交實驗結(jié)果如表2所示。

表2　風(fēng)味蛋白酶酶解L9(34)正交實驗結(jié)果Table 2　The orthogonal experiment result of hydrolysis using flavor protease

圖3　鴿肉酶解液體外抗氧化能力測定結(jié)果Fig.3　The antioxidant properties in vitro of hydrolysates from pigeon meat注：A：還原能力；B：DPPH·清除能力清除能力；D：·OH清除能力。

利用IBM SPSS Statistics 22進行F檢驗得知:水解溫度對水解度有影響(p<0.01),水解時間、加酶量對水解度無影響(p>0.05)。根據(jù)正交實驗分析的結(jié)果,水解度最高的水解工藝組合應(yīng)為A2B1C2,而正交實驗組合中實際水解度最高的工藝組合為A3B3C2。經(jīng)t檢驗,A2B1C2組合及A3B3C2兩者差異不顯著(p>0.05)。考慮節(jié)省時間、蛋白酶消耗量等方面的因素,選擇A2B1C2作為最佳工藝組合,即加酶量600 U/g,溫度55 ℃,水解2.5 h,此條件下水解度為28.69%±0.29%。

2.3　鴿肉酶解液體外抗氧化能力的測定

將得到的鴿肉酶解液按比例進行稀釋,對其進行了抗氧化能力的檢測,并與抗壞血酸的抗氧化能力進行對比,結(jié)果如圖3。

3　結(jié)論

本文研究了幾種蛋白酶對鴿肉蛋白的水解效果,其中風(fēng)味蛋白酶水解效果最佳,對水解工藝進行了優(yōu)化,得到最佳水解條件為:水解溫度55 ℃,加酶量600 U/g(原料),pH為7.0,水解2.5 h,水解度為28.69%±0.29%。酶解液體外抗氧化實驗證實鴿肉酶解液具有良好的抗氧化能力。本研究對鴿肉深加工,尤其是鴿肉氨基酸口服液的研發(fā)具有重要的參考利用價值。

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