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(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070)

大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)是以大豆粕為原料分離提取的一種含高蛋白、低膽固醇的植物蛋白質(zhì)[1]。SPI營養(yǎng)資源豐富,具有乳化性、凝膠性、起泡性等良好的功能性質(zhì),作為功能性食品添加劑被廣泛應(yīng)用[2]。但單一的SPI無法兼具良好的溶解性、乳化穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性,且具有抗原性、過敏源性等缺陷,因此致力于SPI改性,對其功能性和新用途進(jìn)行開發(fā)是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[3-4]。

多糖耦聯(lián)接枝蛋白改性是基于美拉德(Maillard)反應(yīng)的一種綠色的蛋白改性方法。改性后,蛋白的功能特性顯著提高,抗原性降低,抗氧化性、抑菌性等增高[5]。作為中性多糖的葡聚糖(DEX)具有良好的水溶性、安全穩(wěn)定性及良好的生理功能[6]。布冠好等[7]研究了葡聚糖-SPI對大豆蛋白抗原性的影響,得到糖基化產(chǎn)物中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分別降低了36.90%和18.12%。葡聚糖與蛋白耦聯(lián)后,可在水中組裝為兩親性接枝共聚物,潘曉云等[8]人制備得到酪蛋白-葡聚糖共價(jià)結(jié)合物的天然高分子膠束,該膠束可包埋芘、β-胡蘿卜素等疏水化合物。因此,糖接枝蛋白的研究為開發(fā)新型食品添加劑提供了一條新的途徑。

目前傳統(tǒng)的糖接枝工藝存在接枝效率低、反應(yīng)時(shí)間長、褐變程度大等問題,且干熱法由于對溫度、濕度要求嚴(yán)格等不適于大規(guī)模生產(chǎn)[9],故尋找條件溫和、高接枝度、低褐變程度的工藝是急需解決的熱點(diǎn)問題。已有學(xué)者研究過濕法糖基化改性,但葡聚糖接枝蛋白工藝研究甚少。因此本研究以SPI為研究對象,以葡聚糖對其進(jìn)行糖接枝改性,分析了相關(guān)因素對SPI-葡聚糖接枝度(degree of grafting,DG)和褐變度(A420 nm)的影響,利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析,確定最佳工藝條件,從而為糖接枝蛋白的實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

大豆分離蛋白蛋白含量≥95%;葡聚糖分子量50 kDa,上海源葉生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(OPA)、β-巰基乙醇分析純,美國Sigma公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、氫氧化鈉、鹽酸、硼砂、甲醇、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、考馬斯亮藍(lán)等均為分析純。

DK-98-IIA恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司;PB-10 pH計(jì)德國Sartorius;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長城科工貿(mào)有限公司;CR21GIII低溫高速離心機(jī)日本日立公司;UV-1800 UV-Vis分光光度計(jì)日本島津;AvantiJ-E超速冷凍離心機(jī)美國Beckman;S-433 氨基酸分析儀德國Sykam;Direct8超純水系統(tǒng)美國Millipore;PowerPacTM通用電泳儀美國伯樂公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SPI-葡聚糖接枝物的制備將葡聚糖與SPI按照不同物質(zhì)的量之比,以去離子水配制成蛋白質(zhì)量濃度為1.4%的混合液;以0.1 mol/L HCl/NaOH調(diào)節(jié),使混合液pH為7.0,用磁力攪拌器低速攪拌2 h;將混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴,調(diào)節(jié)溫度為50 ℃、溫浴30 min;置于恒溫水浴鍋中,在一定反應(yīng)溫度下接枝反應(yīng)一定時(shí)間后,冰浴5 min,結(jié)束反應(yīng)即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。分別以SPI、恒溫加熱SPI、SPI與葡聚糖物理混合物為對照,進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的對比檢測。

1.2.2工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.2.2.1單因素實(shí)驗(yàn)在蛋白質(zhì)量濃度為1.4%、初步溫浴溫度為50 ℃、時(shí)間為30 min條件下(這些條件在預(yù)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)確定),改變參數(shù),研究反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、蛋白與糖物料比對糖接枝蛋白接枝度與褐變程度的影響。

在反應(yīng)溫度為85 ℃、反應(yīng)時(shí)間7.0 h的條件下,物料比(蛋白∶糖)分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,研究物料比對共價(jià)接枝物制備的影響。

在物料比(蛋白∶糖)為1∶2,反應(yīng)時(shí)間7.0 h的條件下,反應(yīng)溫度分別為75、80、85、90、95 ℃,研究反應(yīng)溫度對共價(jià)接枝物制備的影響。

在物料比(蛋白∶糖的比例)為1∶2、反應(yīng)溫度為85 ℃的條件下,反應(yīng)時(shí)間分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 h,研究反應(yīng)時(shí)間對共價(jià)接枝物制備的影響。

1.2.2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行響應(yīng)面法Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、蛋白與糖物料比為獨(dú)立變量(A、B、C),以接枝度為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1　Variables and levels in response surface

1.2.3接枝度(DG)的測定樣品中游離氨基的含量通過OPA方法檢測[10-12]。配制OPA試劑:將40 mg OPA溶解于1 mL甲醇溶液中,加入25 mL 0.1 mol/L的四硼酸鈉、2.5 mL十二烷基磺酸鈉(20% SDS)、100 μLβ-巰基乙醇、去離子水,以量筒將最終體積定容為50 mL。將200 μL的樣品溶液(蛋白含量為2 mg/mL)加入到4 mL OPA試劑中渦旋振蕩,35 ℃下反應(yīng)2 min,在340 nm下檢測吸光值,來計(jì)算游離氨基含量。樣品接枝度的計(jì)算如式(1)。

式(1)

其中:At代表大豆分離蛋白與多糖共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物所測得的吸光值;A0代表大豆分離蛋白與多糖物理混合物所測定的吸光值。

1.2.4褐變程度(A420 nm)測定取3.0 mL 樣品液加入1.0 mL 稀釋液(含10%(w/w)SDS及0.05 mol/L 硼砂),以稀釋液作空白,在420 nm下測定吸光值A(chǔ)420 nm[13-15]。

1.2.5聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以優(yōu)化工藝制備的接枝物參照LaemmLi[16]法進(jìn)行SDS-PAGE分析。樣品蛋白濃度為2 mg/mL,上樣量10 μL。分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%和3%,分別設(shè)定電壓為120 V和80 V進(jìn)行電泳,以考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.6氨基酸分析以優(yōu)化工藝制備的接枝物進(jìn)行氨基酸分析,參照LaemmLi[16]的方法并作適當(dāng)改進(jìn)。將樣品分別置于消解管中,以6 mol/L HCl溶液水解,抽真空,110 ℃下水解24 h;冷卻、定容、過濾、蒸干后加入0.02 mol/L的HCl 溶液,上樣氨基酸自動(dòng)分析儀中真空放置30 min,對氨基酸含量進(jìn)行測定。

1.2.7溶解度的測定以優(yōu)化工藝制備的接枝物進(jìn)行蛋白質(zhì)溶解能力的測量,參考胡昊等[17]的方法并做適當(dāng)修改?；旌衔镌趽u床中室溫振蕩1 h后,在4 ℃、20000×g下離心20 min。上清液中的蛋白含量通過Lowry法測定[18],樣品溶解度的計(jì)算參見式(2)。

式(2)

1.2.8乳化性的測定以優(yōu)化工藝制備的接枝物進(jìn)行乳化性的測定,參照Pearce[19]的方法并作適當(dāng)改進(jìn)。以0.2 mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液配制蛋白濃度為0.5%(w/v)的樣品溶液。取3 mL樣品液與1 mL玉米油,用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)1 min,分別于0、10 min從底部取樣50 μL,以0.3%(w/v)SDS溶液稀釋200倍后,在500 nm處測吸光值。樣品乳化活性(EAI)的計(jì)算參見式(3)、乳化穩(wěn)定性(ESI)的計(jì)算參見式(4)。

式(3)

式(4)

其中:A0和A10分別為0 min和10 min時(shí)樣品稀釋液所測得的吸光值;DF為稀釋倍數(shù);c為蛋白濃度(g/mL);Φ為乳狀液中油所占比例(v/v)。

1.2.9數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert V8.0.6對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及響應(yīng)曲面繪制,多項(xiàng)式模型方程擬合由決定系數(shù)R2表達(dá),利用F檢驗(yàn)分析顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1物料比對接枝度、褐變程度的影響物料比對接枝度、褐變程度的影響如圖1。隨SPI與葡聚糖的比例由1∶1增加到1∶5,接枝度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,在1∶2處得到最大接枝度43.31%,這是因?yàn)樵谝欢ㄅ浔确秶鷥?nèi),隨葡聚糖增加,產(chǎn)生“大分子擁擠效應(yīng)”,利于糖接枝反應(yīng)的進(jìn)行,但葡聚糖濃度繼續(xù)增大,體系粘度上升,分子流動(dòng)性和擴(kuò)散性變差,蛋白與多糖空間阻礙變大,反應(yīng)程度降低,接枝度變小[20]。褐變程度變化趨勢與接枝度相同,在1∶2處取得最大褐變值0.043,但體系總體褐變程度極低,可忽略不計(jì),因此選擇反應(yīng)物料比為1∶2比較好。

圖1　物料比對糖接枝蛋白接枝度、褐變程度的影響Fig.1　Effect of material ratio on degree of grafting and browning degree of SPI-DEX conjugates

2.1.2反應(yīng)溫度對接枝度與褐變程度的影響隨溫度由75 ℃升至95 ℃,接枝度由27.94%升高至48.81%,后降低至36.76%,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,并在85 ℃取得峰值(圖2)。提高反應(yīng)溫度使蛋白結(jié)構(gòu)疏松,增加蛋白分子中的自由氨基與還原糖羰基的熱運(yùn)動(dòng),利于接枝反應(yīng)的進(jìn)行。但過高的溫度會導(dǎo)致蛋白的熱變性和凝聚現(xiàn)象,自由氨基減少,導(dǎo)致接枝度下降。褐變程度隨溫度升高,呈現(xiàn)不斷增大的趨勢,95 ℃條件下的褐變程度最高,為0.058。高溫促使體系向美拉德反應(yīng)的高級階段進(jìn)行,形成棕色色素,使褐變程度增加,但從褐變值來看,體系總體褐變程度仍然較低。因此,選擇85 ℃為反應(yīng)溫度較好。

圖2　反應(yīng)溫度對糖接枝蛋白接枝度、褐變程度的影響Fig.2　Effect of reaction temperature on degree of grafting and browning degree of SPI-DEX conjugates

2.1.3反應(yīng)時(shí)間對接枝度、褐變程度的影響圖3中顯示的是反應(yīng)時(shí)間對接枝度、褐變程度的影響。隨反應(yīng)時(shí)間由4 h 增加到7 h,接枝度由20.56%增至47.68%,在反應(yīng)7 h取得最大接枝度,因?yàn)榈鞍追肿又饾u展開、解聚,分子內(nèi)部氨基與多糖反應(yīng),接枝度增加;但繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間至9 h,接枝度明顯降低至21.40%,因?yàn)殡S反應(yīng)時(shí)間延長,蛋白水解,自由氨基含量增多,導(dǎo)致計(jì)算出的接枝度減小。褐變指數(shù)隨時(shí)間的延長不斷增大至0.056,但從褐變指數(shù)來看,體系褐變程度仍然很低。因此,選擇7 h為反應(yīng)時(shí)間比較合適。

圖3　反應(yīng)時(shí)間對糖接枝蛋白接枝度、褐變程度的影響Fig.3　Effect of reaction time on degree of grafting and browning degree of SPI-DEX conjugates

2.2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1方差分析及回歸方程由于所得糖接枝蛋白總體褐變程度很低(Amax≤0.06),為得到高接枝度的最佳優(yōu)化工藝,故只以接枝度(DG)為響應(yīng)值,結(jié)果見表2。

表3　回歸方程方差分析Table 3　Variance analyses of regression equation

注：“**”表示差異極顯著(p<0.01);“*”表示差異顯著(p<0.05);“-”表示差異不顯著。

根據(jù)表2結(jié)果,通過Design-Expert軟件分析獲得回歸方程為:糖接枝蛋白接枝度DG(%)=51.77-5.71A-8.26B+4.58C+2.31AB-2.61AC-7.27BC-6.99A2-16.19B2-5.51C2?；貧w方程決定系數(shù)為0.959。從方差分析(表3)可看出,模型失擬項(xiàng)p=0.5218>0.05,不顯著,說明響應(yīng)面分析對實(shí)驗(yàn)擬合性好,實(shí)驗(yàn)誤差小,可分析和預(yù)測糖接枝蛋白制備效果。其中,變量A、B、二次項(xiàng)B2均達(dá)到極顯著水平,變量C、二次項(xiàng)A2、C2均達(dá)到顯著水平,AB、AC交互項(xiàng)不顯著,BC達(dá)到極顯著水平。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Box-Behnken design and experimental results

2.2.2響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化響應(yīng)曲面及等高線見圖4～圖6。蛋白質(zhì)、多糖都是生物大分子,反應(yīng)速度與底物濃度、溫度關(guān)系比較密切,物料比的主效應(yīng)比較顯著,而與反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間的交互作用不顯著,物料比過大或過小均對接枝度有負(fù)面影響。反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間的交互作用達(dá)到極顯著水平,隨著反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的增加,糖接枝蛋白的接枝度迅速提高,然后趨于穩(wěn)定,再逐漸減小。三個(gè)變量中,反應(yīng)溫度對響應(yīng)值的影響最大,物料比次之,反應(yīng)時(shí)間最小。對回歸模型進(jìn)行分析,得到最大響應(yīng)值所對應(yīng)的因素水平分別為:A=1∶1.15,B=82.89 ℃,C=7.33 h,但從儀器的真實(shí)狀況與操作的實(shí)用性考慮,最優(yōu)條件確定為:物料比1∶1.2、反應(yīng)溫度為83 ℃、反應(yīng)時(shí)間為7.3 h,并預(yù)測接枝度最高達(dá)56.90%。

圖4　Y=f(A,B)響應(yīng)曲面及等高線 Fig.4　Response surface and contour for Y=f(A,B)

圖5　Y=f(A,C)響應(yīng)曲面及等高線 Fig.5　Response surface and contour for Y=f(A,C)

圖6　Y=f(B,C)響應(yīng)曲面及等高線 Fig.6　Response surface and contour for Y=f(B,C)

為驗(yàn)證回歸模型,在最優(yōu)工藝下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),接枝度分別為55.96%、56.73%、56.45%,平均56.38%±0.23%?；貧w方程的最大預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)數(shù)值接近,說明回歸方程較真實(shí)地反映了各因素對響應(yīng)值的影響。利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化糖接枝蛋白制備的技術(shù)參數(shù),效果較理想。最優(yōu)工藝制備接枝物的褐變程度A420 nm為0.041。

2.3　接枝物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

圖7為接枝度為52.54%的SPI-DEX與不同對照的電泳圖譜。由圖7可看出,SPI和SPI、DEX物理混合物條帶較為完整,而83 ℃處理7 h的SPI因熱解為多肽,故其亞基條帶(α,β亞基)逐漸消失。與對照相比,高接枝度的糖蛋白樣品圖譜上基本看不到亞基的譜帶,是因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)在酸性條件下通常與蛋白質(zhì)分子上的自由氨基、巰基等活性基團(tuán)以靜電相交互作用而結(jié)合,從而顯藍(lán)色譜帶。而蛋白與糖接枝后,自由氨基減少,故減少了染色劑與蛋白分子的結(jié)合,從而高接枝度樣品電泳凝膠不顯色,因此證明SPI與DEX以共價(jià)鍵結(jié)合。其中最末端條帶的存在,可能是因?yàn)闃悠分泻形茨軈⑴c接枝反應(yīng)的游離氨基酸殘基,此電泳結(jié)果與Safoura[13]、穆利霞[21]研究結(jié)果相同。

圖7　分子量標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.7　SDS-PAGE pattern of molecular weight注:M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1:SPI;2:83 ℃加熱7 h SPI;3:未反應(yīng)SPI、DEX物理混合物;4:SPI-DEX接枝物。

2.4　接枝物的氨基酸組分的變化

表4　SPI與SPI-DEX接枝物的氨基酸含量Table 4　Amino acid content analysis of SPI and SPI-DEX conjugates

蛋白與多糖的耦聯(lián)接枝反應(yīng)是基于蛋白的ε-氨基與多糖的還原性末端之間的美拉德反應(yīng)。如表4可知,SPI與葡聚糖經(jīng)熱處理后,賴氨酸和精氨酸均發(fā)生顯著下降,而賴氨酸和精氨酸是參與接枝反應(yīng)的主要游離氨基酸,這一結(jié)果證明葡聚糖確實(shí)與SPI發(fā)生了接枝反應(yīng)。

2.5　接枝物的溶解性分析

圖8為SPI和SPI-DEX接枝物的溶解度曲線,由圖8可看出,接枝物的溶解度隨pH增大逐漸上升,到pH為7.0處溶解度為99.85%,比原蛋白提高40.48%不受蛋白等電點(diǎn)的影響;而SPI在接近等電點(diǎn)(pH為4.5)處溶解度急速降低為3.59%,在pH為7.0處為59.43%,受等電點(diǎn)影響明顯。SPI-DEX溶解度均明顯高于SPI,t檢驗(yàn)表明,與對照差異極顯著(t=7.67,p=0.00013),這可能是因?yàn)橛H水性葡聚糖接枝在蛋白上,受到親水羥基和電位等因素影響,使SPI溶解度提高。

圖8　SPI與SPI-DEX接枝物的溶解度曲線Fig.8　Solubility curve of SPI and SPI-DEX conjugates

2.6　接枝物的乳化性分析

乳化活性與穩(wěn)定性分別表示蛋白質(zhì)參與形成乳濁液的能力與保持乳液穩(wěn)定,在一定時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)分層絮凝的能力。由表5可看出,接枝物的乳化活性與乳化穩(wěn)定性分別比原蛋白提高69.76%和62.11%。具有較好的乳化性是蛋白質(zhì)與多糖共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物顯著的特征。

表5　SPI與SPI-DEX接枝物的乳化性Table 5　Emulsifying property of SPI and SPI-DEX conjugates

3　討論

接枝溫度與時(shí)間是影響接枝產(chǎn)物功能特性的關(guān)鍵因素,穆利霞等[21]以大豆分離蛋白為原料,與阿拉伯膠混合反應(yīng)16 h制備接枝改性大豆分離蛋白,所得產(chǎn)物褐變指數(shù)為0.7。孫煒煒等[22]以乳清分離蛋白與葡聚糖的混合物在干熱條件下處理7 d,得到接枝度為35.77%、褐變指數(shù)為0.517的接枝產(chǎn)物,因接枝反應(yīng)時(shí)間過長,反應(yīng)向高級階段進(jìn)行,生成類黑精色素、不飽和的棕色含氮聚合體等復(fù)雜產(chǎn)物,使褐變程度增大,產(chǎn)物提純困難。紀(jì)崴等[23]在100 ℃條件下制備乳化性優(yōu)良的大米蛋白-乳糖接枝物,產(chǎn)物褐變程度達(dá)1.254,表明兩者反應(yīng)劇烈。Kim等[24]研究了在100 ℃,初始pH7.8,葡萄糖與甘氨酸、二甘氨酸、三甘氨酸反應(yīng)所得復(fù)合物的特性。研究發(fā)現(xiàn):隨反應(yīng)時(shí)間的延長,所有的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在240 min時(shí)褐變程度達(dá)到最大。因此,選擇較低反應(yīng)溫度、合適反應(yīng)時(shí)間有利于糖與蛋白接枝反應(yīng)的進(jìn)行。本研究中,在反應(yīng)溫度為83 ℃,反應(yīng)時(shí)間為7.3 h的條件下,進(jìn)行大豆分離蛋白與葡聚糖的接枝反應(yīng),條件比較溫和,時(shí)間較短,接枝度較高,而褐變指數(shù)較低;同時(shí),接枝物的理化特性如:溶解度、乳化性及穩(wěn)定性均有明顯改善。

4　結(jié)論

以接枝度、褐變程度為指標(biāo),利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對SPI-DEX接枝蛋白制備的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,SPI-DEX制備的最佳工藝條件為:物料比(蛋白∶糖)1∶1.2,反應(yīng)溫度83 ℃,反應(yīng)時(shí)間7.3 h,此條件下接枝度為56.38%,與理論值56.90%接近,A420 nm為0.041,褐變程度極低,說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化糖接枝蛋白的制備工藝參數(shù)的效果比較好。

分別以聚丙烯酰胺電泳、氨基酸分析鑒定糖接枝蛋白,證明葡聚糖確實(shí)以共價(jià)鍵接枝在蛋白上;糖接枝蛋白在pH為7.0處的溶解度為99.85%,與原蛋白相比提高了40.48%;乳化性、乳化穩(wěn)定性分別比原蛋白提高69.76%和62.11%。

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