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(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心,北京 100083)

番茄紅素(lycopene)是類胡蘿卜素的一種,在番茄、胡蘿卜、木瓜和西瓜等果蔬中大量存在?？扇苡诒?、正己烷、氯仿等有機(jī)溶劑,不溶于水,對(duì)光、熱、氧敏感[1-3]。作為成熟番茄中一種最主要的色素,由于沒(méi)有β-紫羅酮環(huán)結(jié)構(gòu),在過(guò)去只是被當(dāng)作一種沒(méi)有生物活性的植物色素[4-5],很長(zhǎng)時(shí)間都沒(méi)有得到重用。

活性氧被認(rèn)為是引起癌癥、心腦血管疾病以及其他慢性病的重要因素[6-7]。在生物體中,活性氧的水平由一個(gè)復(fù)雜的氧化防御系統(tǒng)網(wǎng)調(diào)控,這個(gè)防御系統(tǒng)可以使生物分子受到的氧化損傷最小化[8]。人體正常狀態(tài)下活性氧的產(chǎn)生和清除處于一個(gè)平衡狀態(tài),但當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病變時(shí),防御系統(tǒng)會(huì)瓦解,活性氧引起的氧化脅迫會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)糖類、脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)等大分子的損傷,破壞其正常功能,并引起一系列如癌癥、衰老以及心血管等疾病的發(fā)生[9-11]。

近年來(lái),越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)和研究表明,番茄紅素作為存在于人體血清和其他組織中主要的類胡蘿卜素,其抗氧化活性要優(yōu)于其他類胡蘿卜素色素,猝滅單線態(tài)氧速率常數(shù)是維生素E的100倍,是β-胡蘿卜素的2倍多[12-16]。因?yàn)槟軌虮Ｗo(hù)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA免受自由基氧化損傷[17],番茄紅素已經(jīng)被很多國(guó)家開發(fā)成為保健食品,我國(guó)市場(chǎng)上也有多種品牌的番茄紅素軟膠囊。各種番茄紅素軟膠囊的主要成分都是番茄紅素和其載體介質(zhì)食用油,而使用的食用油品種并不統(tǒng)一,包括大豆油、玉米油、小麥胚芽油、菜籽油和亞麻籽油等,其中大豆油使用最多,幾乎占據(jù)了80%的市場(chǎng)。關(guān)于番茄紅素的研究日益增多,主要集中在番茄紅素的提取和保健功能方面,包括抗氧化、保護(hù)神經(jīng)系等,尚未有針對(duì)不同食用油對(duì)番茄紅素保健功能影響方面的實(shí)驗(yàn)。研究不同食用油對(duì)番茄紅素保健功能的影響,可以更好的指導(dǎo)生產(chǎn)和消費(fèi),因此本文研究了不同食用油對(duì)番茄紅素抗氧化活性的影響。

本文將番茄紅素分別加載于亞麻籽油、大豆油、葵花籽油、玉米油、花生油介質(zhì)中,測(cè)定該類復(fù)合物對(duì)羥基自由基、DPPH、ABTS和超氧陰離子自由基的清除作用及在β-胡蘿卜素亞油酸自氧化體系中的抗氧化能力,從而研究這幾種油對(duì)番茄紅素抗氧化活性的影響。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

番茄紅素油樹脂5.33%(其他成分為提取油脂-紅花油),晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司;亞麻籽油、花生油、大豆油、葵花籽油、玉米油均購(gòu)于北京物美超市;丙酮(99.5%)、氯化銅(99.0%);碳酸氫鈉(99.5%)、過(guò)硫酸鉀(99.5%)、甲醇(99.5%)、吐溫-20(97%、99.5%)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鄰菲羅啉(99%)、DPPH(99%)、ABTS(98%)、鄰苯三酚(99%)、β-胡蘿卜素(99%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯仿(99%)、亞油酸(60.0%～74.0%)、雙氧水(H2O2,30%)、碳酸鈉(99.8%)、無(wú)水乙醇(99.7%)、鹽酸(36.0%～38.0%)北京化學(xué)試劑有限公司;Tris-HCl緩沖液(99.9%)索萊寶生物科技有限公司。

IKA C-MAGHS7型磁力攪拌器梅特勒-托利多公司;T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;KQ-500DE型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1復(fù)合物的制備配制番茄紅素為4.3%的復(fù)合物,分別稱取不同種類的食用油(玉米油、葵花籽油、花生油、大豆油、亞麻籽油)9.48 g于50 mL離心管中,再加入番茄紅素油樹脂37.52 g,漩渦振蕩至混合均勻。用錫箔紙包裹后,置于-4 ℃冰箱中備用。

1.2.2羥自由基清除能力的測(cè)定參照涂寶軍等[18]的測(cè)定方法并稍加修改。取番茄紅素與食用油的復(fù)合物0.25 g,用丙酮溶解,配制成100 μg/mL的溶液,再用丙酮稀釋配成5、10、20、30、40、50 μg/mL的待測(cè)液。

反應(yīng)液的配制:向10 mL容量瓶中依次注入1.5 mmol/L鄰菲羅啉和2.0 mmol/L的氯化銅各0.5 mL、雙氧水(30%)666.7 μL、0.05 mmol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液8 mL,待測(cè)樣品0.5 mL,并快速混合均勻,以同體積的丙酮作為空白對(duì)照。反應(yīng)液靜置5 min后,在502 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定上述樣品的吸光度并記錄,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,取峰值的平均值進(jìn)行定量,計(jì)算清除率。

式(1)

式中:A0-空白對(duì)照品在502 nm處的吸光度;A樣-樣品反應(yīng)后在502 nm處的吸光度;A本底-樣品在502 nm下的吸光度。

1.2.3DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照涂寶軍等[18]的測(cè)定方法并稍加修改。取番茄紅素與食用油的復(fù)合物0.25 g,用丙酮溶劑進(jìn)行溶解,配制成100 μg/mL的溶液,再通過(guò)稀釋配成5、10、20、30、40、50 μg/mL的待測(cè)液。

DPPH溶液的配制:稱取6.5 mg的DPPH,用無(wú)水乙醇配制成65 μmol/L的溶液。

反應(yīng)液的配制:向10 mL容量瓶中加入8 mL,65 μmol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液,2 mL的待測(cè)樣品,快速混合均勻,用丙酮作為空白對(duì)照。靜置5 min后,在514 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度并記錄,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,取峰值的平均值進(jìn)行定量,計(jì)算清除率。

式(2)

式中:A0-空白對(duì)照品在514 nm處的吸光度;A樣-樣品反應(yīng)在502 nm處的吸光度;A本底-樣品在514 nm下的吸光度。

1.2.4ABTS自由基清除能力的測(cè)定參照鄧麗君等[19]的測(cè)定方法并稍加修改。

ABTS應(yīng)用液的配制:稱取0.0192 g的ABTS和0.0033 g的過(guò)硫酸鉀溶解于10 mL蒸餾水中,配制成3.5 mmol的ABTS溶液,于室溫、避光處放置16～24 h,得到ABTS溶液,用甲醇稀釋至734 nm處的吸光值為0.683的應(yīng)用液。

在反應(yīng)容器中,依次加入待測(cè)樣品0.2 mL,ABTS自由基應(yīng)用液1.3 mL,振蕩搖勻,于室溫下避光靜置6 min后,測(cè)定溶液在734 nm處的吸光度A1。為排除樣品試劑本身顏色的影響將ABTS自由基應(yīng)用液換成甲醇溶液,以95%的甲醇溶液為對(duì)照,于室溫下測(cè)定溶液在734 nm處的吸光度A2。以甲醇溶液代替待測(cè)樣品,同樣以95%的甲醇溶液為對(duì)照,測(cè)定溶液在734 nm處的吸光度A0。

每組測(cè)定3次,求取平均值,按下述公式計(jì)算樣品的清除率。并繪制清除率與樣品吸光度曲線。

式(3)

式中:A0-含ABTS應(yīng)用液不含待測(cè)樣品的反應(yīng)體系的吸光值;A1-樣品反應(yīng)后的吸光值;A2-含待測(cè)樣品不含ABTS應(yīng)用液反應(yīng)體系的吸光值[20]。

1.2.5超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定參照劉國(guó)安等[8]的測(cè)定方法并加以修改。

取0.5 mL不同濃度樣品,加入4.43 mL pH=8.0的Tris-HCl(50 mmol/L)緩沖液后,加入70 μL鄰苯三酚溶液(10 mmol/L),立刻計(jì)時(shí)并迅速搖勻,在反應(yīng)啟動(dòng)后每隔30 s檢測(cè)相應(yīng)325 nm處的吸光值,至4.5 min為止。對(duì)照管用鹽酸代替鄰苯三酚溶液。

式(4)

式中:A0-未加樣品的吸光值;A1-加入樣品的吸光值;A2-未加鄰苯三酚的吸光值。

1.2.6β-胡蘿卜素—亞油酸自氧化體系參照Gachkar等[21]的測(cè)定方法并加以修改。

β-胡蘿卜素氯仿溶液配制:準(zhǔn)確稱取15 mgβ-胡蘿卜素,用氯仿定容至10 mL容量瓶中,配制為濃度為1.5 mg/mL的β-胡蘿卜素氯仿溶液。

乳化液的配制:稱取40 mg亞油酸和400 mg吐溫-20,放入圓底燒瓶中,再加入0.4 mL的β-胡蘿卜素氯仿溶液,在40 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5 min,然后向殘余物中加入100 mL蒸餾水不斷攪拌,在40 kHz超聲波中超聲10 min。

其中空白乳化溶液的配制除不添加β-胡蘿卜素外,步驟同上。

檢測(cè):準(zhǔn)確量取5 mL的乳化液,加入0.2 mL的不同待測(cè)樣品后,馬上于470 nm下測(cè)定吸光度值(t=0 min)。然后在60 ℃下水浴120 min,每30 min測(cè)定一次吸光度值。

抗氧化能力用 IC50值及動(dòng)力學(xué)反應(yīng)速率綜合來(lái)衡量。其中,根據(jù)公式(5)計(jì)算各樣品的抗氧化活性值,通過(guò)非線性擬合計(jì)算得到各物質(zhì)的 IC50值;依照公式(6)計(jì)算反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的響應(yīng)值(β-胡蘿卜素殘留率)。

式(5)

式中:DRc=ln(ac/bc)/120,表示對(duì)照溶液的降解速率;DRs=ln(as/bs)/120表示樣品溶液的降解速率;ac為0 min時(shí)的對(duì)照溶液吸光度值;bc為120 min時(shí)的對(duì)照溶液吸光度值;as為0 min時(shí)的樣品溶液吸光度值;bs為120 min時(shí)的樣品溶液吸光度值。

式(6)

式中:As(t=x)和As(t=0)分別代表樣品在t=x min及t=0 min時(shí)的吸光度值。

1.2.7數(shù)據(jù)處理采用Origin 8.5軟件作圖,SPSS 20軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　羥基自由基清除能力的測(cè)定

羥基自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的一種活性氧。按1.2.2的實(shí)驗(yàn)方法,得到番茄紅素油樹脂和幾種食用油復(fù)合物自由基清除率的結(jié)果如圖1,除了質(zhì)量濃度為10 μg/mL的花生油和大豆油,其他各種油的羥基自由基清除率之間存在極顯著性差異(p<0.01);同種油不同質(zhì)量濃度樣品之間也存在極顯著性差異(p<0.01)。在一定范圍內(nèi),隨著番茄紅素提取物質(zhì)量濃度的增加,羥基自由基的清除率逐步提高。其中亞麻籽油復(fù)合物對(duì)羥基自由基的清除效果明顯好于其它的食用油,花生油和大豆油復(fù)合物對(duì)羥基自由基也有較強(qiáng)的清除能力,在30 μg/mL時(shí)清除率顯著增加。此實(shí)驗(yàn)表明不同食用油與番茄紅素復(fù)合對(duì)羥基自由基的清除能力有顯著差異。

圖1　不同樣品對(duì)羥基自由基的清除效果Fig.1　Effect of different samples on hydroxyl radicals scavenging rate注:不同字母表示不同樣品間有極顯著性差異(p<0.01),相同字母表示兩者間沒(méi)有顯著性差異(p>0.05),圖4同。

2.2　DPPH自由基清除能力的測(cè)定

按1.2.3的實(shí)驗(yàn)方法,得到番茄紅素油樹脂和幾種食用油復(fù)合物DPPH自由基清除率的結(jié)果如圖2,不同食用油和番茄紅素復(fù)合物對(duì)DPPH的清除效果有顯著性差異(p<0.05),尤其在質(zhì)量濃度大于20 μg/mL后,差異性更顯著(p<0.05)。質(zhì)量濃度在0～40 μg/mL范圍內(nèi),對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨濃度的增大而增大,其中亞麻籽油和番茄紅素復(fù)合物的清除能力最強(qiáng),在40 μg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值,隨后清除率開始下降,這可能是因?yàn)閺?fù)合物為脂溶性,含量過(guò)高不能與反應(yīng)液良好的混合,降低了對(duì)DPPH自由基的清除效果。此外,花生油的DPPH自由基清除率僅次于亞麻籽油而優(yōu)于其它幾種植物油,其清除率隨著濃度增大呈上升趨勢(shì),在50 μg/mL時(shí),其清除效果要比亞麻籽油的最佳效果(即質(zhì)量濃度為40 μg/mL時(shí)的清除效果)好,但是兩者間沒(méi)有顯著差異。大豆油和玉米油的DPPH自由基清除能力沒(méi)有顯著差異。

圖2　不同樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.2　Effect of different samples on DPPH radicals scavenging rate注：不同字母表示不同樣品間有顯著性差異(p<0.05)，相同字母表示兩者間沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)，圖3同。

2.3　ABTS自由基清除能力的測(cè)定

ABTS法作為物質(zhì)抗氧化能力的評(píng)定方法之一,使用廣泛[22]。按1.2.4的實(shí)驗(yàn)方法,得到番茄紅素油樹脂和幾種食用油復(fù)合物ABTS自由基清除能力的結(jié)果如圖3所示,不同的油和番茄紅素的復(fù)合物對(duì)ABTS的清除效果有顯著性差異(p<0.05)。亞麻籽油和番茄紅素的復(fù)合物對(duì)ABTS自由基清除能力最強(qiáng),但當(dāng)質(zhì)量濃度大于30 μg/mL后,亞麻籽油的自由基清除能力開始下降,再次說(shuō)明番茄紅素?cái)z入適量,效果更好。此外,隨著濃度的增加葵花籽油的自由基清除能力的增長(zhǎng)速度最快,在50 μg/mL時(shí),與亞麻籽油差異最小。對(duì)于花生油,在質(zhì)量濃度小于30 μg/mL時(shí),清除率隨質(zhì)量濃度增加而顯著增加,大于30 μg/mL后,增幅變緩。

圖3　不同樣品對(duì)ABTS的清除效果Fig.3　Effect of different samples on ABTS radicals scavenging rate

2.4　超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

超氧陰離子自由基和羥基自由基同屬于活性氧自由基,性質(zhì)十分活潑,能夠誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生氧化損傷[23]。按1.2.5的實(shí)驗(yàn)方法,不同的復(fù)合物對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果有極顯著性差異(p<0.01)。番茄紅素油樹脂和幾種食用油復(fù)合物超氧陰離子自由基清除能力的結(jié)果如圖4所示,對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而增大,清除能力順序?yàn)?亞麻籽油>花生油>葵花籽油>大豆油>玉米油。亞麻籽油復(fù)合物在40 μg/mL時(shí),清除效果極顯著增加(p<0.01),其它復(fù)合物均在30 μg/mL時(shí)極顯著增加(p<0.01),因此,在成本最小、效果最好的前提下,亞麻籽油復(fù)合物選擇40 μg/mL,而其它復(fù)合物選擇30 μg/mL。

圖4　不同樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Fig.4　Effect of different samples on superoxide anion radicals scavenging rate

2.5　β-胡蘿卜素—亞油酸自氧化體系

β-胡蘿卜素—亞油酸自氧化體系是一種常用的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法,原理是亞油酸在高溫下產(chǎn)生的過(guò)氧化氫使β-胡蘿卜素褪色[24],而通過(guò)添加抗氧化劑及含有抗氧化物質(zhì)的天然提取物,則可以使β-胡蘿卜素的褪色反應(yīng)被抑制[21]。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好的重復(fù)性,β-胡蘿卜素-亞油酸系統(tǒng)中的變量越少越好,因此本實(shí)驗(yàn)中唯一的變量是食用油的不同。

2.5.1IC50值法β-胡蘿卜素-亞油酸自氧化體系中不同復(fù)合物的抗氧化能力達(dá)到50%時(shí)的濃度值(IC50)見(jiàn)圖5。從圖5中可知,不同混合物表現(xiàn)出不同的抗氧化活性。基本為亞麻籽油>花生油>大豆油>葵花籽油>玉米油。

圖5　β-胡蘿卜素-亞油酸體系中不同樣品抗氧化能力達(dá)到50%的濃度值Fig.5　IC50 values of test samples in β-carotene and linoleic acid system

2.5.2動(dòng)力學(xué)反應(yīng)速率各樣品中不同反應(yīng)時(shí)間的β-胡蘿卜素殘留率如圖6所示,隨著時(shí)間延長(zhǎng),各反應(yīng)樣品中β-胡蘿卜素殘留率逐漸下降,這與加熱因素導(dǎo)致亞油酸上的活性亞甲基脫氫,引發(fā)烷基游離基產(chǎn)生并進(jìn)一步產(chǎn)生過(guò)氧游離基,從而引發(fā)亞油酸的自氧化反應(yīng),并大量產(chǎn)生游離基,這些游離基能與β-胡蘿卜素反應(yīng)使之快速褪色有關(guān)。同時(shí),亞麻籽油復(fù)合物抗氧化能力最強(qiáng),大豆油和葵花籽油復(fù)合物的抗氧化能力較弱,玉米油復(fù)合物隨時(shí)間延長(zhǎng)抗氧化能力逐漸下降,最終β-胡蘿卜素殘留率高于花生油。

圖6　各樣品在40 μg/mL濃度時(shí)β-胡蘿卜素殘留率隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6　The dependence of residual rate on time of incubation at a concentration of 40 mg/mL of investigated samples in β-carotene bleaching test

3　結(jié)論

綜上所述,與其它食用油相比,亞麻籽油與番茄紅素復(fù)合后具有更強(qiáng)的抗氧化能力。這可能是因?yàn)閬喡樽延褪悄壳皀-3含量最高的已知油脂之一,α-亞麻酸和亞油酸含量高達(dá)60%以上,還含有維生素E等,與番茄紅素有抗氧化協(xié)同作用。同時(shí)花生油中不飽和脂肪酸的含量也較高,所以在很多方面花生油復(fù)合物的抗氧化性僅次于亞麻籽油復(fù)合物。大豆油復(fù)合物對(duì)羥基自由基、DPPH自由基和ABTS也有較好的清除效果,這也許是大豆油成為人們首選的原因之一。玉米油與葵花籽油復(fù)合物的抗氧化能力大多不及其它食用油,但在某些質(zhì)量濃度時(shí)也有較好的抗氧化性。因此,消費(fèi)者不能一概而論,應(yīng)該注意抗氧化能力也受番茄紅素質(zhì)量濃度的影響。

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