葉夢斐，孫曉棠，張 磊，崔汝強

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江西水稻根結(jié)線蟲病的發(fā)生及鑒定

葉夢斐，孫曉棠，張 磊，崔汝強*

（江西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，江西 南昌 330045）

2016年，江西省南昌縣和新建縣的直播水稻出現(xiàn)大面積的斑塊狀枯黃，調(diào)查發(fā)現(xiàn)這些水稻的根部具有根結(jié)，同時從土壤當中分離到大量的根結(jié)線蟲2齡幼蟲。運用分子生物學技術(shù)對采自這2個水稻種植地的根結(jié)線蟲進行鑒定，確定該根結(jié)線蟲為擬禾本科根結(jié)線蟲（）。擬禾本科根結(jié)線蟲病是水稻產(chǎn)區(qū)一種重要的線蟲病害，在我國江西則是首次發(fā)現(xiàn)。

擬禾本科根結(jié)線蟲；水稻；鑒定；江西

根結(jié)線蟲（spp.）廣泛分布于世界各地，寄主范圍廣，危害大，是最具危險性的植物寄生線蟲之一，世界每年由根結(jié)線蟲所引起經(jīng)濟上重要農(nóng)作物的損失占總損失的5%。水稻根結(jié)線蟲寄生在水稻根部，植株地上部僅表現(xiàn)株矮，葉黃，生勢衰弱等癥狀，根部有大量根結(jié)出現(xiàn)導致秧苗無法進一步形成須根。多發(fā)生在直播稻、育秧田、灌溉地水稻、低洼地水稻、旱稻等田塊。

由擬禾本科根結(jié)線蟲（Golden & Birchfield，1963）引起的水稻根結(jié)線蟲病是水稻產(chǎn)區(qū)重要的病害之一[1]。該線蟲病在北美洲、南非、東南亞等地發(fā)現(xiàn)并造成嚴重危害。一般中等發(fā)病情況下，影響水稻產(chǎn)量約10%~20%左右，嚴重發(fā)病時可達40%~50%[2-6]。目前引起水稻根結(jié)線蟲病的線蟲種類多種，而擬禾本科根結(jié)線蟲僅在我國海南三亞及福建的水稻、蔥（）有記錄[7-9]，但未見造成水稻損失的報道。近年來在江西南昌縣、新建縣等地發(fā)生水稻根結(jié)線蟲病，造成局部嚴重為害。鑒于其經(jīng)濟重要性及病害的突發(fā)性，作者對病原線蟲進行鑒定，報道如下：

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2015年2—7月，在江西省的南昌和新建直播稻種植區(qū)采集水稻根及根際土。采用貝曼漏斗分離法[10]分離土壤中的根結(jié)線蟲雄蟲和2齡幼蟲，收集根結(jié)線蟲在水稻根部的卵囊，用單卵囊接種到溫室培養(yǎng)的水稻苗上，進行根結(jié)線蟲純化擴繁培養(yǎng)。

1.2 單條 0. nnnn活蟲DNA的提取

在解剖鏡下將水稻根結(jié)線蟲單條的二齡幼蟲用解剖刀切斷后加入含有8 μL WLB溶液［含2.5 mmol/L DTT，( Tween20) = 1.125%，0.25 g/L Gelatin，125 mmol/L KCl，3.75 mmol/L MgCl，25 mmol/L Tris－HCl ( pH 8.3) ］的PCR管中，于-70 ℃放置30 min后；95 ℃處理15 min；隨后65 ℃溫浴2 min；再加入20 mg/mL的蛋白酶K 1 μL，65 ℃溫浴30 min；95 ℃處理15 min后作為單根結(jié)線蟲PCR擴增的DNA模板[11]。

1.3 DNA鑒定

利用引物C2F3（5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3′）和1108（5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′）[12]對水稻根結(jié)線蟲序列進行擴增。PCR反應(yīng)的混合液總體積為50 μL。反應(yīng)體系為：2 μL模板DNA，5 μL10×PCR buffer，4 μL dNTPs（10 mmol/L），1 μL引物ITS1/ ITS4（10 μmol/L），0.3 μL TaKaRa（5 U/L），36.7 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃，4 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，1 min；32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.4 PCR產(chǎn)物的電泳檢測

取PCR產(chǎn)物各3mL，12 g/L瓊脂糖中加5% EB染液，100 V電泳35 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。根據(jù)DL2000 Marker推斷PCR擴增產(chǎn)物大小。切膠回收PCR產(chǎn)物連接到pMD18T載體上，單菌落PCR篩選出來的陽性克隆。

1.5PCR產(chǎn)物測序及序列分析

陽性克隆送上海Life生物有限公司進行測序分析。測序結(jié)果登錄到GenBank 數(shù)據(jù)進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

水稻根結(jié)線蟲病在整個水稻生育期都能感染發(fā)病，目前江西主要在直播稻的苗期發(fā)病明顯。發(fā)病部位主要在水稻根部，地上部分表現(xiàn)出植株矮小，黃化，生長不良等癥狀。

圖1 水稻根結(jié)線蟲病在水稻根部的主要癥狀

水稻根結(jié)線蟲病，由根結(jié)線蟲二齡幼蟲自根冠上方侵入到水稻根部，在根內(nèi)尋找寄生位點并與水稻建立寄生關(guān)系，進一步發(fā)育成成蟲。在根結(jié)線蟲食道腺分泌的效應(yīng)子的作用下于寄生位點形成巨型細胞，造成水稻根部膨大形成根瘤，并影響水稻須根的形成（圖1），進而影響秧苗對水分和營養(yǎng)的吸收，地上部分表現(xiàn)為秧苗矮小，黃化，生長不良，分蘗量下降等癥狀（圖2）。

圖2 水稻根結(jié)線蟲病田間癥狀

2.2 PCR擴增結(jié)果

采用引物C2F3和1 108對擬禾本科根結(jié)線蟲DNA序列PCR擴增，經(jīng)12 g/L瓊脂糖電泳檢測分析顯示，各單條線蟲樣品均增出特異性較好片段約為500 bp的產(chǎn)物（圖3）。

圖3 單條擬禾本科根結(jié)線蟲擴mtDNA電泳

2.3 分子鑒定結(jié)果

對PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果表明該片段為531 bp，將該片段登錄GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對分析顯示與數(shù)據(jù)庫中已知擬禾本科根結(jié)線蟲（GU187309)同源性為100%?？蓪⒃摼€蟲鑒定為擬禾本科根結(jié)線蟲。

3 討 論

本研究利用特異DNA序列鑒定出在江西省的南昌和新建的直播稻發(fā)生的水稻根結(jié)線蟲病的的病原為擬禾本科根結(jié)線蟲，目前該病原線蟲已經(jīng)對江西省部分直播稻種植區(qū)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，本研究也是首次對江西省擬禾本科根結(jié)線蟲為害直播稻的詳細報道。1963年在美國路易斯安那州的光頭稗（L.）上首次發(fā)現(xiàn)了擬禾本科根結(jié)線蟲[11]，隨后研究表明該線蟲可寄生水稻、蔥以及多種單子葉雜草的根部，為害水稻后會造成嚴重減產(chǎn)，甚至毀田[12]。

江西省地處亞熱帶溫暖濕潤季風氣候，雨量多、年平均氣溫在16~19 ℃，而且作物經(jīng)常多年連續(xù)種植，導致各種病害發(fā)生嚴重，且在水稻生長季節(jié)特別適合根結(jié)線蟲病的發(fā)生。一旦根結(jié)線蟲在水稻種植區(qū)定殖下來，很難將其根除。防治該病害則會浪費大量的財力與人力。因此水稻根結(jié)線蟲病的預(yù)防是直播稻生產(chǎn)管理的一個重要問題。由于以前在我省水稻上并為大面積發(fā)現(xiàn)水稻根結(jié)線蟲病為害，而且水稻根結(jié)線蟲病地上部分表現(xiàn)的癥狀與營養(yǎng)不良、缺素癥等癥狀類似，容易被農(nóng)民及農(nóng)技推廣人員忽視。為了保證江西省糧食生產(chǎn)安全，應(yīng)對我省主要的直播稻種植區(qū)開展水稻根結(jié)線蟲病害的普查及防治推廣培訓工作；同時，在播種前，對前一生長季節(jié)疑似發(fā)病的田塊進行土壤處理，且定期做好除草工作。

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Identification ofFrom Rice in Jiangxi Province

YE Meng-fei, SUN Xiao-tang, ZHANG Lei, CUI Ru-qiang*

(School of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In 2016, yellow patches emerged on rice in Xianjian County and Nanchang County of Jiangxi Province. Root knots were observed in the rice roots, and numerous juvenile second stage (J2) worms belonging to the genuswere isolated from soils around the rice roots. The root knot nematodes were identified by using mtDNA-PCR-sequence. The results indicated that the root knot was. Worldwide,is known to be an important pathogen of rice in most rice growing area, however, the nematode was found firstly on rice in Jiangxi Province.

；rice；identification；Jiangxi

S432.4＋5；Q959.17

A

2095-3704（2018）01-0052-03

2017-11-04

2017-11-21

國家自然科學基金項目(31260423)、江西省自然科學基金項目（20151BAB204024）、江西省科技支撐計劃(20151BBF60076)和江西省教育廳基金項目(GJJ160347)

葉夢斐(1993—)，女，碩士生，主要從事植物病理學研究，1193315379@qq.com；

通信作者，崔汝強，副教授，博士，cuiruqiang@jxau.edu.cn。

葉夢斐, 孫曉棠, 張磊, 等. 江西水稻根結(jié)線蟲病的發(fā)生及鑒定[J]. 生物災(zāi)害科學, 2018, 41(1): 52-54.