孫　旭， 郝玉敏， 蔡金傍， 戴傳超

(1.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210023； 2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇南京 210042；3.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046)

我國(guó)農(nóng)業(yè)廢棄物種類(lèi)繁多且數(shù)量巨大，其中農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量約為7×108t，秸稈中含有大量的有機(jī)質(zhì)及微量元素，是一種綜合利用價(jià)值較高的可再生資源[1]。但目前我國(guó)秸稈利用方式相對(duì)粗放，除直接還田以及作為燃料、飼料外，每年約有2×108t秸稈未經(jīng)處理在田間堆放或焚燒，造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[2]。

堆肥是農(nóng)業(yè)秸稈減量化和資源化最為經(jīng)濟(jì)有效的方式之一，但由于秸稈中含有大量的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等難降解成分，導(dǎo)致自然堆肥腐熟時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)品質(zhì)量差，不利于高效利用秸稈[3-4]。研究表明，接種外源功能微生物可以有效地促進(jìn)木質(zhì)素等物質(zhì)的降解，加快堆肥腐熟進(jìn)程，提高發(fā)酵物肥力[5-7]。

內(nèi)生真菌生長(zhǎng)在植物內(nèi)部，它對(duì)植物的侵染過(guò)程也是水解木質(zhì)素和纖維素的過(guò)程，研究表明部分內(nèi)生真菌可降解纖維素并產(chǎn)生油脂，對(duì)植物凋落物具有較強(qiáng)的降解能力[8]。史央等從重陽(yáng)木中分離出1株植物內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉B3，可離開(kāi)宿主存活于土壤中，該B3菌能分泌漆酶，促進(jìn)土壤纖維素酶活性，加快茅蒼術(shù)凋落物和花生秸稈的降解[9-11]。本研究以擬莖點(diǎn)霉B3為外源接種菌劑，研究其對(duì)稻稈豬糞堆肥進(jìn)程及產(chǎn)品質(zhì)量的影響，以期為農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用水稻秸稈為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的長(zhǎng)度為 1～2 cm 的干碎料；豬糞采自鎮(zhèn)江三明生物工程有限責(zé)任公司的新鮮豬糞；蘑菇渣為金壇阿波羅生物制品有限公司提供的金針菇發(fā)酵物，3種物料的基本特性如表1所示。植物內(nèi)生擬莖點(diǎn)霉屬菌株B3(Phomopsisliquidambari)分離自重陽(yáng)木；水堇種子購(gòu)于江蘇宿遷鑫巖花卉園。

表1　3種試驗(yàn)物料的基本性質(zhì)

1.2　稻稈豬糞腐熟試驗(yàn)

擬莖點(diǎn)霉B3菌劑制備：擬莖點(diǎn)霉B3以馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，500 mL三角瓶中固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)麩皮 ∶糠 ∶稻殼=6 ∶3 ∶1(質(zhì)量比)，按料液比1 g ∶1.2 mL加入滅菌水。擬莖點(diǎn)霉B3菌液以10.0%接種量接入固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻后在28.0 ℃條件下靜置培養(yǎng)1周，有效活菌數(shù)達(dá)到 104CFU/g。

堆肥試驗(yàn)于2012年12月13日至2013年1月14日進(jìn)行。采用6個(gè)口徑為27.0 cm、高為20.0 cm的花盆進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)花盆內(nèi)含500 g水稻秸稈，300 g蘑菇渣，300 g豬糞，混勻后碳氮比約為28.0。隨機(jī)選取3個(gè)花盆作為B3處理組，分別加入 150 g 的B3固體發(fā)酵物，另設(shè)3個(gè)不加任何處理的空白對(duì)照組(CK)。加入一定量蒸餾水，調(diào)節(jié)含水率在70.0%左右，進(jìn)行好氧高溫發(fā)酵，堆肥時(shí)間設(shè)為32 d。從堆肥當(dāng)天開(kāi)始每8 d從堆體取100 g左右樣品，一部分樣品用自封袋密封，保存于4.0 ℃冰箱中，用于E4/E6值、種子發(fā)芽指數(shù)和微生物數(shù)量的測(cè)定；另一部分樣品于105.0 ℃條件下烘干粉碎過(guò) 0.8 mm 篩，用于測(cè)定有機(jī)質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分、木質(zhì)素、纖維素的含量。

1.3　測(cè)定方法

E4/E6值測(cè)定方法[12]：稱(chēng)取2.5 g堆肥樣品于50 mL離心管中，加入25 mL蒸餾水，離心后取上清液，用分光光度計(jì)分別在465、665 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算其比值。

種子發(fā)芽指數(shù)測(cè)定[13]：稱(chēng)取5 g鮮樣放于三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，充分振蕩，30 ℃條件下浸提24 h，過(guò)濾取6 mL濾液加到鋪濾紙的培養(yǎng)皿中，將10粒水堇種子置于其中，室溫條件下放置48 h，每個(gè)處理重復(fù)3次，同時(shí)以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定發(fā)芽指數(shù)。

有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化法[14]測(cè)定；全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效磷、速效鉀含量參照土壤測(cè)試方法[15]測(cè)定；木質(zhì)素含量采用濃硫酸法[16]測(cè)定；纖維素含量采用改進(jìn)的濃酸水解定糖法[16]測(cè)定；微生物數(shù)量采用平板稀釋法[14]測(cè)定。

1.4　數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)處理間的差異顯著性。Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1　稻秸豬糞發(fā)酵物有機(jī)質(zhì)含量變化

由圖1可知，不同處理堆肥過(guò)程中有機(jī)質(zhì)含量整體呈下降趨勢(shì)。接種擬莖點(diǎn)霉B3能夠促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的分解，在堆肥升溫期和高溫期(0～16 d)微生物代謝活動(dòng)較旺盛，有機(jī)質(zhì)被大量分解。在16 d時(shí)，CK和B3處理堆肥中有機(jī)質(zhì)含量分別為483.6、362.2 g/kg，比開(kāi)始時(shí)減少18.0%(P<0.05)和 44.3%(P<0.01)；在后腐熟階段，大部分易降解有機(jī)質(zhì)被分解，微生物活性減弱，有機(jī)質(zhì)降解速率變慢并趨于穩(wěn)定，在 32 d 時(shí)CK和B3處理分別比開(kāi)始時(shí)有機(jī)質(zhì)含量減少21.2%(P<0.01)和44.3%(P<0.01)。表明接種外源功能微生物可以促進(jìn)稻稈豬糞堆肥有機(jī)物質(zhì)的降解，加快堆肥反應(yīng)進(jìn)程。

2.2　稻稈豬糞發(fā)酵物E4/E6值的變化

在降解過(guò)程中稻稈豬糞產(chǎn)生了大量的腐殖酸，其含量是堆肥腐殖化的一個(gè)重要指標(biāo)，可用來(lái)判斷堆肥腐熟程度。堆肥腐殖酸在465、665 nm處具有特征吸收峰，其在465、665 nm處吸光度比值(E4/E6)通常被用來(lái)反映腐殖質(zhì)的縮合和芳構(gòu)化程度，通常E4/E6比值越低，腐殖化和聚合程度越高，分子量越大。由圖2可知，接種B3處理堆肥E4/E6值呈先上升后下降的趨勢(shì)，在8 d時(shí)達(dá)到最大值3.0，之后迅速下降，在24 d時(shí)B3處理堆肥中E4/E6值為1.6，比開(kāi)始時(shí)下降43.9%，此時(shí)降解物的芳構(gòu)化程度較高，形成大量的腐殖質(zhì)。接種B3處理堆肥E4/E6值較CK低(P<0.01)，結(jié)果表明，添加菌劑能促進(jìn)腐殖質(zhì)的縮合和芳構(gòu)化，加快稻稈腐殖化，形成更加穩(wěn)定的腐殖質(zhì)。

2.3　稻秸腐熟過(guò)程中纖維素、木質(zhì)素含量的變化

水稻秸稈主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素組成，含量分別在36.7%、24.8%、25.2%左右，這類(lèi)物質(zhì)不易降解，導(dǎo)致自然堆肥腐熟時(shí)間較長(zhǎng)、堆肥產(chǎn)品質(zhì)量差，不利秸稈的高效利用。

2.3.1纖維素含量變化由圖3可知，在腐熟過(guò)程中B3處理的纖維素含量一直在下降，而纖維素的降解率持續(xù)上升。在前16 d內(nèi)纖維素降解較快，CK和B3處理的纖維素含量分別下降15.3%、39.2%。堆肥結(jié)束時(shí)對(duì)照和B3處理堆肥中纖維素含量分別為24.3%、16.7%，分別比開(kāi)始時(shí)下降30.7%、50.5%，表明接種B3菌有利于纖維素的降解。

2.3.2木質(zhì)素含量變化水稻秸稈腐熟過(guò)程中木質(zhì)素的降解最為緩慢。由圖4可知，對(duì)照組木質(zhì)素的含量一直在下降，從開(kāi)始的25.7%降至32 d的17.2%，下降 33.1%；接種B3處理堆肥中木質(zhì)素經(jīng)16 d的降解，含量從開(kāi)始的24.1%降至15.1%(P<0.01)，下降37.3%，后16 d降解較為緩慢。表明內(nèi)生擬莖點(diǎn)霉B3在水稻秸稈木質(zhì)素降解過(guò)程中起了很大的作用。

2.4　稻秸腐熟過(guò)程中微生物數(shù)量的變化

堆肥是以微生物為媒介的復(fù)雜生化過(guò)程，細(xì)菌、真菌、放線菌在有機(jī)質(zhì)的降解中發(fā)揮著重要作用，其數(shù)量在堆肥的不同階段是不同的。

2.4.1細(xì)菌數(shù)量變化細(xì)菌是堆肥腐熟過(guò)程中數(shù)量最多的微生物，可快速分解糖類(lèi)、淀粉和蛋白質(zhì)類(lèi)易降解物質(zhì)，部分細(xì)菌也參與纖維素的分解，進(jìn)行自身生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)生熱量。由圖5可知，除B3處理32 d堆肥樣品外，不同處理堆料中細(xì)菌數(shù)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。堆肥升溫期，堆料中易降解物質(zhì)較多，細(xì)菌迅速繁殖，在堆肥高溫期，大多數(shù)細(xì)菌死亡，細(xì)菌數(shù)量降低，接種B3處理比對(duì)照處理的堆料中細(xì)菌數(shù)量多。堆肥開(kāi)始時(shí)B3處理和對(duì)照的細(xì)菌數(shù)量分別為3.2×109、1.8×109CFU/g，分別在8、16 d時(shí)達(dá)到最大值，分別為5.5×109CFU/g和3.2×109CFU/g，接種B3處理細(xì)菌數(shù)量比對(duì)照處理高71.9%。表明接種外源功能菌B3有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，能加速堆肥發(fā)酵的啟動(dòng)，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的降解。

2.4.2放線菌數(shù)量變化稻稈豬糞堆肥腐熟過(guò)程中放線菌的數(shù)量低于細(xì)菌和真菌，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。由圖6可知，在堆肥前期放線菌數(shù)量逐漸升高，接種B3處理放線菌數(shù)量在8 d時(shí)達(dá)到最大值，為3.8×108CFU/g，比對(duì)照放線菌數(shù)量高65.2%(P<0.05)；在高溫期放線菌數(shù)量維持在一個(gè)較高的水平，而在降溫期放線菌數(shù)量持續(xù)下降。研究表明，在高溫期纖維素和木質(zhì)素的分解主要由放線菌完成，其數(shù)量和種類(lèi)也會(huì)有所增加[17]。接種內(nèi)生擬莖點(diǎn)霉B3明顯增加堆肥腐熟過(guò)程中放線菌數(shù)量，產(chǎn)生更多的木質(zhì)纖維素分解酶類(lèi)，加速木質(zhì)素的降解，從而促進(jìn)水稻秸稈的腐熟。

2.4.3真菌數(shù)量變化堆肥腐熟過(guò)程中真菌數(shù)量的變化趨勢(shì)與細(xì)菌相似，但數(shù)量低于細(xì)菌。由圖7可見(jiàn)，在堆肥前期真菌數(shù)量持續(xù)升高，接種B3處理真菌數(shù)量在8 d時(shí)達(dá)到最大值，為2.6×109CFU/g，比對(duì)照真菌數(shù)量高83.8%(P<0.05)；在高溫期大部分真菌處于休眠狀態(tài)或死亡，導(dǎo)致其數(shù)量急劇下降；在堆肥結(jié)束時(shí)接種B3處理真菌數(shù)量達(dá)到 2.6×108CFU/g，比對(duì)照真菌數(shù)量高25.7%(P<0.05)，且低于堆肥起始的真菌數(shù)量。

2.5　稻秸豬糞發(fā)酵物對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)的影響

種子發(fā)芽指數(shù)(germination index，簡(jiǎn)稱(chēng)GI)常被用來(lái)測(cè)定堆肥的生物毒性，它是表征堆肥腐熟水平的重要生物學(xué)指標(biāo)之一。一般認(rèn)為，當(dāng)GI大于50.0%時(shí)，可認(rèn)為堆肥發(fā)酵物對(duì)作物基本無(wú)毒性，堆料基本腐熟；當(dāng)GI大于80.0%時(shí)，堆料已沒(méi)有植物毒性且已腐熟。由圖8可知，不同處理的堆肥發(fā)酵物GI呈先下降后上升的趨勢(shì)。堆肥開(kāi)始時(shí)有機(jī)質(zhì)未分解，對(duì)植物抑制作用小，B3和CK的GI分別為87.0%、77.0%(P<0.05)，由于接種B3后加快了有機(jī)質(zhì)的降解，產(chǎn)生了較多的有毒物質(zhì)(氨和低級(jí)脂肪酸等)，抑制了水堇種子的發(fā)芽，在 8 d 時(shí)B3處理的GI為63.0%，低于CK的73.0%。隨著堆肥的進(jìn)行，有毒物質(zhì)減少，16 d時(shí)B3處理堆肥GI達(dá)到80.0%，顯著高于CK處理的67.0%(P<0.05)，表明堆肥已達(dá)到腐熟狀態(tài)，堆肥結(jié)束時(shí)B3處理和CK處理堆肥GI分別為83.0%和77.0%。結(jié)果表明，接種擬莖點(diǎn)霉B3有助于降低堆肥發(fā)酵物植物毒性，加快堆肥腐熟進(jìn)程。

2.6　稻稈豬糞發(fā)酵物養(yǎng)分含量的變化

堆肥過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，伴隨著有機(jī)物的降解及氮、磷、鉀的釋放和固定，氮、磷、鉀的含量直接影響最終堆肥產(chǎn)品質(zhì)量。堆肥產(chǎn)品的養(yǎng)分含量是評(píng)價(jià)堆肥產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一。水稻秸稈和豬糞經(jīng)過(guò)32 d好氧高溫堆肥后，不同處理的堆肥產(chǎn)品品質(zhì)有所差異，接種擬莖點(diǎn)霉B3能明顯提高堆肥產(chǎn)品中養(yǎng)分含量。由表2可知，B3處理堆肥中全氮和速效氮含量分別增加23.7%(P<0.05)和19.9%(P<0.05)；全磷和速效磷含量分別增加33.3%(P<0.05)和 35.3%(P<0.05)；全鉀和速效鉀含量分別增加14.3%(P>0.05)和9.2%(P>0.05)。

表2　堆肥產(chǎn)品養(yǎng)分含量

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。

3　結(jié)論與討論

堆肥是在微生物的作用下，將復(fù)雜的有機(jī)物分解為細(xì)胞可利用的小分子物質(zhì)，并形成穩(wěn)定腐殖質(zhì)的過(guò)程。自然堆肥腐熟時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)品質(zhì)量差，不利于農(nóng)業(yè)廢棄物的高效利用，微生物接種技術(shù)具有使堆體快速升溫、無(wú)二次污染、提高堆肥質(zhì)量的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用在堆肥中[3]。大量的研究表明，接種微生物菌劑能增加堆肥初期微生物數(shù)量，提高微生物代謝活性，加快有機(jī)物的降解，促進(jìn)堆料的腐熟，例如在堆肥初期接種芽孢桿菌和鏈霉菌，可在堆肥過(guò)程中增加細(xì)菌數(shù)量，加速有機(jī)質(zhì)分解[18]；接種EM菌劑(effective microorganisms)有利于堆肥礦化作用，縮短堆肥腐熟時(shí)間5～8 d[19]。

擬莖點(diǎn)霉B3是從重陽(yáng)木中分離得到的1株植物內(nèi)生真菌，可離開(kāi)宿主在土壤中存活30 d，能與大多數(shù)微生物形成互利共生關(guān)系[10]。該B3菌能分泌降解木質(zhì)素的關(guān)鍵酶——漆酶，粗酶液經(jīng)50 ℃處理1 h后，仍能保持83.1%的活性，且pH值在6～8時(shí)，酶活較為穩(wěn)定，從而促進(jìn)堆肥過(guò)程中木質(zhì)素和纖維素的分解[11，20]。當(dāng)環(huán)境中可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)，擬莖點(diǎn)霉B3可被誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶和木質(zhì)素酶，加快茅蒼術(shù)凋落物和花生秸稈的降解[10，21]。本研究在稻稈豬糞堆肥初期接入有效活菌數(shù)為104CFU/g的擬莖點(diǎn)霉B3菌劑，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，接種擬莖點(diǎn)霉B3菌劑能增加堆肥升溫期和高溫期細(xì)菌、真菌、放線菌的代謝活性和細(xì)胞數(shù)量，其中有些放線菌能產(chǎn)生木質(zhì)纖維素的分解酶類(lèi)，例如放線菌(Streptomycessp.)在以秸稈為唯一碳源時(shí)能產(chǎn)生大量的纖維素酶，在70 ℃時(shí)仍具有較高的酶活性[22]；在牛糞堆肥中存在大量的高溫放線菌GPL 1可產(chǎn)生完整的纖維素酶系，對(duì)甘蔗、濾紙、微晶纖維素等均具有較好的降解作用，從而促進(jìn)有機(jī)質(zhì)、木質(zhì)素、纖維素的降解，形成更加穩(wěn)定的腐殖質(zhì)[23]。種子發(fā)芽指數(shù)是評(píng)價(jià)堆肥腐熟效果和生物毒性的關(guān)鍵指標(biāo)，接種擬莖點(diǎn)霉B3的處理在16 d時(shí)種子發(fā)芽指數(shù)達(dá)到 80.0%，遠(yuǎn)高于對(duì)照的67.0%，表明堆肥完全腐熟且無(wú)生物毒性。因此，接種擬莖點(diǎn)霉B3能加快堆肥腐熟進(jìn)程，縮短腐熟時(shí)間。

堆肥過(guò)程中有機(jī)物被不斷分解，同時(shí)由于含水率的下降，堆體中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)產(chǎn)生“濃縮效應(yīng)”，使養(yǎng)分相對(duì)含量增加，有利于提高堆肥產(chǎn)品質(zhì)量。接種擬莖點(diǎn)霉B3菌劑的處理經(jīng)32 d腐熟后，堆體中全氮、速效氮、速效磷含量顯著增加，與前人研究結(jié)果[24]一致。有一些菌種雖然對(duì)秸稈的降解能力強(qiáng)，但同時(shí)也是植物致病菌，不能作為秸稈腐熟菌劑，研究表明，擬莖點(diǎn)霉B3不僅對(duì)水稻、大豆、花生等作物生長(zhǎng)無(wú)毒害作用，還能促進(jìn)水稻分蘗、大豆結(jié)瘤、緩解花生連作障礙等[9，25-26]。

稻稈豬糞在自然堆肥過(guò)程中，有機(jī)質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素降解緩慢，形成穩(wěn)定腐殖質(zhì)的時(shí)間長(zhǎng)，堆肥產(chǎn)品養(yǎng)分含量和種子發(fā)芽指數(shù)較低，腐殖化進(jìn)程較慢。向稻稈豬糞高溫堆肥中添加內(nèi)生擬莖點(diǎn)霉B3菌劑，能增加堆肥升溫期和高溫期微生物的數(shù)量，加速有機(jī)質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素的降解，縮短腐殖質(zhì)的形成時(shí)間，提高堆肥產(chǎn)品中全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效磷、速效鉀含量，提高種子發(fā)芽指數(shù)，減少對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制，提升堆肥產(chǎn)品品質(zhì)。

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