江　偉， 于小飛， 田永蘭， 柴　陽， 熊元武， 鐘　馨， 張化永

(華北電力大學(xué)工程生態(tài)學(xué)與非線性科學(xué)研究中心，北京 102206)

土壤重金屬污染已經(jīng)成為一個世界性問題，在當(dāng)代科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注[1-2]。據(jù)報道，由于工業(yè)廢水不合理排放、農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品不合理使用、含鎘磷肥的使用以及汽車尾氣排放等，我國農(nóng)業(yè)主產(chǎn)區(qū)土壤中的鎘含量已經(jīng)有明顯的積累現(xiàn)象[3]。鎘污染對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要影響，首先，農(nóng)作物從受污染土地中吸收鎘，農(nóng)作物生長發(fā)育受到抑制，產(chǎn)量大幅降低[4]。其次，土壤鎘污染也會使農(nóng)產(chǎn)品中的重金屬鎘含量超標(biāo)，而使植物蛋白質(zhì)、葉綠素、糖、維生素C等含量降低[5]。因此，如何有效地處理土壤中的鎘污染，已經(jīng)成為近年來環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的突出問題。

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)屬于無患子科文冠果屬，落葉小喬木，適應(yīng)性強(qiáng)，在草沙地、撂荒地、多石的山區(qū)、黃土丘陵和溝壑等處，甚至在崖畔上都能正常生長發(fā)育。在我國的分布范圍為8°37′～47°20′N、73°20′～120°25′E，遍布華北、華東及西北地區(qū)。其種子含油率高達(dá)74%，由文冠果籽油制備的生物柴油相關(guān)烴脂類成分含量高，內(nèi)含18C的烴類占93.4%，且無硫、氮等因子污染環(huán)境，符合現(xiàn)行的優(yōu)質(zhì)生物柴油指標(biāo)，是北方理想的木本油料樹種[6]。

針對鎘污染日益嚴(yán)重的現(xiàn)狀，植物修復(fù)技術(shù)成為一種新型的、低成本的、環(huán)境友好的解決土壤鎘污染問題的手段，尤其適合發(fā)展中國家。利用文冠果來修復(fù)重金屬鎘污染土壤，再將收獲的文冠果果實用于生物柴油的生產(chǎn)，既可以改善環(huán)境質(zhì)量，又可以實現(xiàn)資源化。有研究表明，文冠果對鎘污染具有較高的耐受性，其生長過程中的株高、莖粗、生物量等僅在土壤中鎘達(dá)到200 mg/kg時才受到顯著抑制[7]。截至目前，對文冠果生長過程中土壤微生物的變化與重金屬之間關(guān)系的研究尚未見報道，而文冠果種植地區(qū)的土壤污染卻不容忽視，其在生物能源產(chǎn)出和土壤污染修復(fù)方面的作用會在未來能源環(huán)境領(lǐng)域逐漸凸顯。

本研究采用溫室盆栽試驗，通過長期試驗，考察不同生長期下的文冠果土壤微生物對重金屬鎘的響應(yīng)，采用Biolog Eco微平板研究人工污染土壤中外源鎘不同濃度對土壤微生物活性與功能多樣性的影響，以期為實現(xiàn)能源木本植物修復(fù)鎘污染土壤提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

本試驗選取的文冠果購自河南省洛陽市嵩縣綠源綠化種苗科研有限公司。

供試土壤采自北京農(nóng)學(xué)院試驗田，土壤為黃褐土。取0～20 cm表層土壤，新鮮土樣去除植物殘體、礫石等，自然風(fēng)干，過2 mm篩備用，土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1　土壤基本理化性質(zhì)

1.2　試驗設(shè)計

試驗設(shè)置4個鎘濃度梯度：0、10、50、100 mg/kg(以純鎘計)，文冠果種子經(jīng)浸泡發(fā)芽后移栽到裝有7 kg含有不同濃度的鎘污染土壤的花盆中，每盆定苗2株，每個處理3個重復(fù)，溫室中培養(yǎng)，整個生長過程用自來水澆灌以維持田間持水量約為60%。盆栽試驗于2009年5月中旬開始，在2009年7月19日、2009年9月14日、2009年11月12日等3個生長期時間點取樣。樣品采集時，在距植株主干8 cm處挖取2個直徑為2.5 cm、深12 cm的土樣，混合組成樣品。采集的新鮮土樣過2 mm網(wǎng)篩，一部分土樣放在4 ℃冰箱保存，供微生物指標(biāo)分析；另一部分土樣自然風(fēng)干，供土壤基本理化性狀測定。

1.3　測定方法

1.3.1土壤微生物群落功能多樣性分析本試驗采用Shannon指數(shù)(H)和Gini系數(shù)(G)反映不同處理下土壤微生物多樣性的差異。Shannon指數(shù)是反映群落豐富度和分布均勻程度的綜合指標(biāo)，是目前應(yīng)用最為廣泛的群落多樣性指數(shù)之一。Gini系數(shù)表示微生物的均勻度，G介于0～1之間，當(dāng)G=0時表示微生物群落分布絕對均勻，當(dāng)G=1時表示微生物群落分布絕對不均勻。

1.3.2Biolog Eco微平板本研究中功能多樣性的測定采用基于Biolog Eco微平板的碳素利用法，具體操作過程如下：將Biolog Eco微平板從冰箱內(nèi)取出，25 ℃預(yù)熱15 min。稱取相當(dāng)于5 g烘干土壤質(zhì)量的新鮮土樣，加入內(nèi)有45 mL 0.85% NaCl溶液(質(zhì)量濃度)的三角瓶中，用8層紗布封口，在 200 r/min 搖床中振蕩30 min。手搖數(shù)秒后，迅速用滅菌的吸管吸取1 mL土壤懸液，加入內(nèi)有9 mL 0.85% NaCl溶液的試管中，手搖數(shù)秒后，迅速用滅菌的吸管吸取2 mL土壤懸液，加入內(nèi)有18 mL 0.85% NaCl溶液的試管中得到10-3稀釋液。用自動多頭移液器接種，接種量為150 μL/孔。將接種好的測試板加蓋在25 ℃下保濕暗培養(yǎng)10 d，每隔12 h用Biolog自動讀數(shù)裝置在590 nm下測定吸光度[8]。

平均顏色變化率[9](average well color development，簡稱AWCD)的表達(dá)式為AWCD=[∑(Ci-R)]/31，其中Ci是除對照孔外所測得31個反應(yīng)孔的吸光度，R是對照孔的吸光度。

1.4　數(shù)據(jù)分析

為了避免接種密度帶來的差異，本研究運(yùn)用AWCD接近0.6時的數(shù)據(jù)計算多樣性指數(shù)，進(jìn)行主成分分析。試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007處理，相關(guān)性分析、方差分析以及主成分分析等多元統(tǒng)計分析采用軟件SPSS 16.0及Matlab 7.0實現(xiàn)。本試驗中，對數(shù)據(jù)先進(jìn)行泰勒轉(zhuǎn)換或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行主成分分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　鎘污染對文冠果土壤微生物活性的影響

土壤微生物接種到Biolog Eco微平板后，微生物利用板中的碳源使指示劑變色，隨著碳源消耗量的增加指示劑顏色加深，從而相應(yīng)碳源的吸光度增大。AWCD表征微生物群落碳源利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的一個重要指標(biāo)，反映了土壤微生物的整體活性。

AWCD的變化曲線分3個變化階段，滯后期、對數(shù)增長期和穩(wěn)定期。由圖1可知，在文冠果的第1生長期(或拔節(jié)期)，與空白對照相比，10 mg/kg鎘對土壤微生物群落總體活性影響不大，50、100 mg/kg鎘使土壤微生物活性降低。在第2生長期，10 mg/kg鎘使微生物活性明顯增加，而50、100 mg/kg 鎘對其影響不大。在第3生長期，各處理組表現(xiàn)出與第1生長期相似的趨勢。

生長期對微生物的活性也有一定的影響，隨著生長時間的延長，空白對照及50、100 mg/kg鎘處理中土壤微生物的活性變化趨勢均表現(xiàn)為先下降后上升，10 mg/kg鎘處理的趨勢與之相反，表現(xiàn)為先上升后下降。鎘污染濃度為10 mg/kg時，第2生長期的AWCD最高，而其他處理則表現(xiàn)為第1生長期的AWCD最高，第2生長期的AWCD低于其他2個生長期。

2.2　鎘污染對文冠果土壤微生物多樣性的影響

從表2可以看出，在文冠果的整個生長過程中，當(dāng)鎘的濃度為100 mg/kg時，Shannon指數(shù)(土壤微生物的豐富度、均勻度)最高，方差分析結(jié)果表明，這種差異并不顯著。對文冠果Gini指數(shù)(土壤微生物活性)的分析發(fā)現(xiàn)，在第2生長期，當(dāng)鎘的濃度為10 mg/kg時，土壤微生物活性最高，而此時微生物的豐富度、均勻度最低，表明在該濃度鎘污染下，微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，鎘耐性微生物成為優(yōu)勢種，鎘敏感微生物種群降低。

表2　不同處理下文冠果土壤微生物功能多樣性指數(shù)

注：表中數(shù)據(jù)為3個樣品的平均值。每列數(shù)據(jù)后不同大寫字母、每行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　鎘污染對文冠果土壤微生物代謝圖譜的影響

由圖2-A可知，應(yīng)用主成分分析法在31個主成分中提取的2個主成分因子，分別可以解釋原變量特征的26.84%、25.27%。用第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)作圖表征文冠果第1生長期土壤中微生物的代謝特征。主成分得分系數(shù)的方差分析結(jié)果表明，PC1得分系數(shù)差異顯著(F3，8=6.196，P=0.018<0.05)。這種差異主要表現(xiàn)在圖2-A中 100 mg/kg 鎘處理的微生物群落落在PC1正方向，對照、10 mg/kg 鎘處理的微生物群落位于PC1的負(fù)方向，50 mg/kg鎘處理的微生物群落居中，說明100 mg/kg鎘處理與對照及10 mg/kg鎘處理差異顯著。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，D-纖維二糖、α-D-乳糖、i-赤蘚糖醇、D，L-α-磷酸甘油、α-丁酮酸、甘氨酰-L-谷氨酸、2-羥基苯甲酸、苯乙胺等與PC1正相關(guān)，衣康酸、丙酮酸甲酯、L-天門冬酰胺、吐溫-80等與PC1負(fù)相關(guān)。

文冠果第2生長期土壤中微生物的代謝特征見圖2-B，得分系數(shù)的方差分析結(jié)果表明，PC1得分系數(shù)差異極顯著(F3，8=12.556，P=0.002<0.01)。這種差異主要表現(xiàn)在圖2-B中10 mg/kg鎘處理的微生物群落落在PC1負(fù)方向，對照及50 mg/kg鎘處理的微生物群落位于PC1的正方向，說明10 mg/kg鎘處理與對照及50 mg/kg鎘處理之間差異極顯著，而對照及50、100 mg/kg鎘處理之間并無顯著性差異，以上結(jié)果表明與空白對照相比，高濃度的鎘污染并沒有改變微生物群落碳源利用的功能多樣性，證明文冠果土壤微生物對鎘污染具有一定的耐受性，在鎘污染條件下仍可以保持特定的活性能力。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，α-D-乳糖、D-木糖/戊醛糖、i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-葡糖胺酸、L-絲氨酸等與PC1正相關(guān)，說明10 mg/kg鎘濃度的土壤中，微生物降低了對上述碳源的利用率。而衣康酸、糖苷與PC1負(fù)相關(guān)，表明10 mg/kg鎘濃度的土壤中，微生物增加了對這些碳源的利用率。

文冠果第3生長期土壤中微生物的代謝特征見圖2-C，PC1、PC2得分系數(shù)的方差分析結(jié)果表明，各處理之間得分系數(shù)差異不顯著(PC1：F3，8=2.197，P=0.166>0.05，PC2：F3，8=0.328，P=0.810>0.05)。說明在第3生長期土壤微生物群落沒有顯著變化，這與AWCD變化一致，這可能是由于交換態(tài)鎘會隨時間的延續(xù)而逐漸減小所造成的。

3　結(jié)論與討論

微生物是土壤中生物量最大、種類最豐富的類群，對于重金屬污染，土壤微生物與其直接接觸、關(guān)系密切，與植物相比微生物對污染物的反應(yīng)更加靈敏。曾路生等在水稻盆栽條件下，添加外源鎘，發(fā)現(xiàn)鎘濃度較低時，土壤微生物量碳和氮與鎘濃度呈正相關(guān)關(guān)系，而較高的鎘濃度使二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，鎘濃度的轉(zhuǎn)折點因土壤性質(zhì)有所差異[10]。本試驗中發(fā)現(xiàn)的當(dāng)鎘濃度為 10 mg/kg 時可以提高微生物的生物量，增加微生物代謝活性的結(jié)論與之相一致。本研究中，高濃度的鎘污染對文冠果土壤微生物的影響不大，說明文冠果對重金屬鎘具有一定的耐受性。隨著生長期的延長，在第3生長期，鎘污染對文冠果土壤微生物的影響有減弱的趨勢，主要是由于重金屬元素在土壤中的活性或有效性會隨其存在的時間發(fā)生變化，交換態(tài)鎘會隨時間的延續(xù)而逐漸減小[11]。Ipsilantis等通過盆栽試驗對高濃度鉻污染下芥菜根際微生物群落進(jìn)行研究，4周后，土壤中鉻的有效態(tài)明顯降低，微生物的多樣性提高，可能是由于重金屬使優(yōu)勢種的優(yōu)勢度降低，從而消除了優(yōu)勢種對其他物種的競爭抑制作用，使微生物的多樣性有所提高[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)的鎘濃度為100 mg/kg時微生物豐富度、均勻度最高，而鎘濃度為10 mg/kg時微生物豐富度、均勻度最低這一結(jié)論與之相似。另外，段學(xué)軍等采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探討重金屬鎘污染條件下稻田土壤微生物種群的基因多樣性，證明低濃度鎘對某些微生物類群具有一定的刺激作用，個別種群對鎘脅迫較為敏感，種群數(shù)量大大降低[13]。

環(huán)境微生物研究中，Biolog Eco微平板由于操作簡單得到廣泛應(yīng)用，且這種方法能夠獲得豐富的數(shù)據(jù)，從而能直觀反映微生物種群的整體活性。彭芳芳等利用Biolog Eco微平板技術(shù)探索鈾污染與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，通過計算各樣品的AWCD、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等來指示微生物的結(jié)構(gòu)和功能變化，得到最終結(jié)論，不同濃度的鈾污染會使土壤微生物的AWCD降低37.6%～92.0%[14]。對Biolog Eco數(shù)值進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落代謝多樣性表現(xiàn)出差異的主要碳源為碳水化合物類，其次是氨基酸類以及胺類[14]。目前，關(guān)于這些大分子與微生物之間的相互調(diào)節(jié)作用，國內(nèi)主要利用Biolog Eco微平板試驗，但須要新的方法、新的思路補(bǔ)充進(jìn)來以便更深入地研究。魯順保等引用國外的MicroResp方法研究了澳大利亞3種類型森林(濕地松、南洋杉、貝殼杉)土壤微生物的功能多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤pH值對微生物利用L-丙氨酸、精氨酸、D-(+)-葡萄糖、N-乙酰基-氨基葡萄糖的影響較大，這些類群的微生物主要分布在貝殼杉林地；分布在南洋杉林地的微生物對檸檬酸、L-蘋果酸和γ-酪氨酸的利用率較大，且主要是受總磷含量的影響；D-(+)-果糖、檸檬酸和L-半胱氨酸-鹽酸等受水分、總氮含量、總碳含量等的影響較大，這類微生物類群主要分布在濕地松林地[15]。MicroResp方法結(jié)合了Biolog和底物誘導(dǎo)呼吸2種方法的優(yōu)點，可以研究整個土壤中微生物的代謝功能，且耗費低、研究周期短[16]，可以作為將來試驗設(shè)計的一種參考。另一方面，為了了解鎘等重金屬污染與微生物群落結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，可以深入利用分子生物學(xué)技術(shù)研究微生物群落組成[17-18]。微生物代謝周期較短，從遺傳學(xué)或進(jìn)化學(xué)角度考慮，微生物群落結(jié)構(gòu)變化過程是一個優(yōu)勝劣汰的過程，鎘添加過程作為外界刺激會造成微生物遺傳信息的變化，更深一步，可以考慮從基因、蛋白質(zhì)組學(xué)或基因組學(xué)角度來解釋這種變化發(fā)生的根本原因[19]。

本研究利用主成分分析法研究了鎘添加條件下微生物對碳源利用的變化，可以從側(cè)面反映微生物群落變化和微生物活性變化，例如，在第1生長期內(nèi)，100 mg/kg鎘促進(jìn)了以D-纖維二糖、α-丁酮酸、甘氨酰-L-谷氨酸、2-羥基苯甲酸、苯乙胺等為營養(yǎng)的微生物的生存，而抑制了以衣康酸和糖苷為碳源的微生物的存活。從圖1和表2來看，鎘添加對微生物活性的影響在第2生長周期表現(xiàn)的最明顯，土壤微生物活性升高，多樣性降低，利用碳水化合物的土壤微生物種群降低，能利用多聚物的微生物種群增加。這很可能是重金屬鎘的選擇性所致，利用碳水化合物的微生物對鎘敏感，在鎘的作用下種群數(shù)降低；能利用衣康酸、肝糖的微生物對重金屬鎘有耐受性，種群數(shù)升高。Roane等通過DNA分析，檢測鎘污染及無污染土壤中的微生物組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎘污染的土壤中可培養(yǎng)的微生物數(shù)量減少，但能分離出抗性微生物[20]。鎘耐性微生物成為優(yōu)勢種，鎘敏感微生物種群降低，因此文冠果第2周期應(yīng)該是對鎘添加最敏感的時期，在今后研究鎘對文冠果土壤微生物影響時應(yīng)格外關(guān)注。

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