楊正久， 代建忠， 梁大敏， 毛朝坤， 董紅梅， 馬增鳳

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系，貴州遵義 563006； 2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

黨參為桔?？泣h參屬植物，川黨參產(chǎn)于四川、貴州、湖南、湖北、陜西等省，歷史悠久，品種較多，已大量人工栽種，不同品種間的性狀與藥用成分含量存在差異。洛龍黨參又名洛黨，產(chǎn)于貴州省道真仡佬族苗族自治縣東北部的洛龍山區(qū)而得名，是川黨參的生態(tài)變種[1]，以其肉質(zhì)鮮嫩、藥用價(jià)值高而深受外界青睞。黨參主要成分有多糖、黨參苷、甾醇類、生物堿、內(nèi)酯類、豆素類等，具有益氣生津、補(bǔ)脾養(yǎng)胃的功效，用于脾肺虛弱、氣短心悸、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等病癥[2]。余蘭等研究表明，洛龍黨參的多糖含量達(dá)25.6%～27.75%，比其他川黨參高10.97%[3]。

目前分子標(biāo)記用于黨參種質(zhì)遺傳多樣性的研究較少，利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)道真洛龍黨參種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究還尚未見報(bào)道。本研究利用ISSR技術(shù)對(duì)道真陽溪和壩羊的洛龍黨參與四川、重慶等地其他川黨參的種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行研究，為貴州省遵義市種植黨參品種的鑒定、篩選利用及遺傳改良提供方法和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料及來源

本研究共采用12個(gè)黨參品種(表1)，分別來自貴州省遵義道真縣、重慶、湖北及四川種植黨參種子萌發(fā)的嫩葉。選取成熟種子，脫粒去雜，催芽后，置于放有濾紙的培養(yǎng)皿上于 25 ℃ 萌發(fā)，發(fā)芽3～5 cm高時(shí)取幼苗嫩葉，置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　儀器與試劑

主要儀器：GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，Eppendorf Mastercycler?普通PCR儀，Smart SpecTM3000型分光光度計(jì)(BIO-RAD)，VE-180型電泳槽(上海天能科技有限公司)，EPS-300型電泳儀(上海天能科技有限公司)，TGL-16G 臺(tái)式離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。主要試劑：丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、硝酸銀、37%甲醛、四乙基乙二胺(TEMED)、ISSR引物(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)。

表1　試驗(yàn)材料及來源

1.3　黨參基因組DNA的提取

取黨參試驗(yàn)材料，采用經(jīng)改進(jìn)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取DNA[4-5]，用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定其純度，用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，將提取的DNA稀釋到終濃度 40 ng/μL，用作PCR擴(kuò)增的模板。

1.4　ISSR引物的篩選和PCR擴(kuò)增

選用提取的黨參基因組DNA為模板，進(jìn)行ISSR引物篩選和PCR反應(yīng)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板DNA 1 μL(約30～53 ng)，ISSR引物1 μL(約5 pmol)，PCR mix 18 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL 在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，以0.5×TBE為緩沖液，穩(wěn)壓150 V，電泳至溴酚藍(lán)距凝膠邊緣2～3 cm處結(jié)束。采用銀染法進(jìn)行染色。

1.5　數(shù)據(jù)處理與分析

ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，得到電泳圖譜，用Quantity One 6. 0分析軟件結(jié)合人工讀帶，按條帶的有無(有記為1，沒有則記為0)記錄電泳條帶，同時(shí)將出現(xiàn)頻率超過99%的條帶視為共有帶，出現(xiàn)頻率低于1%的條帶，即被視為沒有條帶而不計(jì)入內(nèi)。將讀出的數(shù)據(jù)錄入Excel，建立數(shù)據(jù)庫(kù)矩陣。

應(yīng)用NTsys 2.10e軟件，利用ISSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)計(jì)算黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建黨參品種間的遺傳關(guān)系聚類圖；將SM遺傳相似性矩陣進(jìn)行Dcenter數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，求其特征量和特征向量，生成主坐標(biāo)二維、三維散點(diǎn)圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　ISSR引物的篩選及擴(kuò)增結(jié)果

以來自道真陽溪1號(hào)和2號(hào)黨參基因組DNA作為模板，從100條引物中篩選出10條引物。利用這10條引物能在12個(gè)黨參試驗(yàn)材料中擴(kuò)增出清晰的條帶，且多態(tài)性、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好(表2)。

表2　引物篩選及擴(kuò)增結(jié)果

2.2　ISSR-PCR圖譜及多態(tài)性分析

本研究從100條引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的10條引物，對(duì)12份供試黨參樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出136個(gè)可區(qū)分的DNA條帶，平均每條引物擴(kuò)增出13.6條條帶(表2)。在擴(kuò)增出的136條DNA條帶中，多態(tài)性條帶有114條，多態(tài)性條帶占比為83.82%，平均每條引物擴(kuò)增11.4條多態(tài)性條帶。其中引物UBC807和UBC811擴(kuò)增的條帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)較為豐富(圖1)，DNA總條帶數(shù)分別為16條和19條，多態(tài)性條帶數(shù)分別為14條和16條。這表明川黨參種質(zhì)具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.3　遺傳相似性分析

利用ISSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)計(jì)算黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)(表3)。ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，12個(gè)黨參品種之間的遺傳相似性系數(shù)均在0.5以上，平均為0.683 6，處于 0.518～0.908之間。其中道真陽溪洛龍黨參品種(1)和四川樂山黨參品種(12)之間的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.518，二者之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；四川樂山(12)和四川雅安(10)之間的遺傳相似性系數(shù)最大，表明二者之間的親緣關(guān)系最近。道真縣的3個(gè)洛龍黨參品種(1、2、3)之間的遺傳相似性系數(shù)均較大，在0.775以上，但道真洛龍黨參品種與四川地區(qū)的6個(gè)品種(7～12)之間的遺傳相似性系數(shù)較小，在0.50～0.65之間，表明遵義道真洛龍黨參品種與四川地區(qū)黨參品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3　遺傳相似性分析結(jié)果

2.4　聚類分析

基于遺傳圖距，應(yīng)用NTsys 2.10e軟件，對(duì)來自道真洛龍、四川、重慶及湖北的12個(gè)黨參品種進(jìn)行UPGMA聚類分析。如圖2所示，12個(gè)黨參品種在0.591處分為A、B 2支，來自遵義道真、重慶及湖北的6個(gè)黨參品種(1～6)聚為A支，來自四川省的6個(gè)黨參品種(7～12)聚為B支，而A支中來自道真洛龍和重慶奉節(jié)與巫山的黨參品種又聚為A1支，A1支又分為A11(道真3個(gè)品種)和A12(重慶2個(gè)品種)2支，來自湖北的黨參品種(6)單獨(dú)成1支(A2支)，來自四川的6個(gè)黨參品種分為B1和B22支，但遺傳差距很小。結(jié)果表明，本研究中的12個(gè)黨參種植品種與地理分布有著明顯的相關(guān)性，來自同一地區(qū)的品種間遺傳差異較小，而不同地區(qū)的品種之間的遺傳差異最大。

2.5　主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析以黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)矩陣為基礎(chǔ)，不同品種在主坐標(biāo)圖中的位置能反映它們之間的親緣關(guān)系。品種間位置越接近，表明它們的遺傳相似性越大，親緣關(guān)系越近，反之，則表明遺傳差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)[6]。產(chǎn)生的主坐標(biāo)二維、三維散點(diǎn)圖分別見圖3、圖4。不難看出，主坐標(biāo)分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。來自道真洛龍的3個(gè)黨參品種(1～3)遺傳相似性較高，聚集在二維圖的右上角，來自重慶及湖北的3個(gè)黨參品種分布在二維圖的右下方；來自四川的6個(gè)黨參品種(7～12)遺傳距離較遠(yuǎn)，分布在二維圖的左側(cè)，由于四川的6個(gè)黨參品種間的遺傳差異很小，因此密集地聚集在一起。從三維圖上更能看出品種間的分類很明顯。

3　結(jié)論與討論

DNA分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展至今已有幾十種，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)由于具有成本低、可靠性及穩(wěn)定性高，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到各類研究中，是理想的分子標(biāo)記技術(shù)[7-8]。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究黨參遺傳多樣性的報(bào)道不多，陳大霞等用21條ISSR引物對(duì)18份川黨參材料擴(kuò)增出223個(gè)DNA條帶，其中有166個(gè)多態(tài)性條帶，平均多態(tài)率為74.44%[9]；郭宏波從100條ISSR中篩選出13條引物，對(duì)來自山西和甘肅2省的150份黨參材料進(jìn)行分析，擴(kuò)增出127個(gè)清晰的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶122個(gè)，平均多態(tài)率為95.77%[10]。以上研究表明，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，適合用于種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。

本研究選用洛龍黨參和四川、重慶、湖南各產(chǎn)地種植黨參品種，以黨參的幼苗為材料，對(duì)CTAB法進(jìn)行優(yōu)化改良，提取黨參基因組DNA。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，從100條不列顛哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的ISSR引物中篩選，以不同產(chǎn)地種植黨參的基因組DNA為模板，用篩選的ISSR引物進(jìn)行分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增，用聚丙烯酰胺電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，有利于擴(kuò)增產(chǎn)物的分辨。本次篩選出的10條ISSR引物對(duì)12個(gè)黨參品種共擴(kuò)增出136個(gè)清晰的DNA條帶，多態(tài)性條帶114條，平均多態(tài)性比例為83.82%，最高為92.86%，最低為71.43%。其中引物UBC811擴(kuò)增出的DNA條帶總數(shù)和多態(tài)性DNA條帶數(shù)最多，分別為19條和16條；而引物UBC835擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)最少，只有8條，多態(tài)性DNA條帶數(shù)6條。ISSR標(biāo)記DNA圖譜表明，洛龍黨參與其他川黨參具有豐富的基因資源?；蛐褪沁z傳和生態(tài)2個(gè)因素長(zhǎng)期復(fù)雜的相互作用的產(chǎn)物，土壤和地理環(huán)境對(duì)種內(nèi)變異起重要作用[11]。黨參大面積的種植通常采用種子和種根2種繁殖方式[9]，零星種植也常采用野生種及半野生種的馴化栽培，因此黨參種源復(fù)雜，加上道真、四川、重慶及湖北等地不同土壤和地理環(huán)境以及氣候與光照的影響，造成了黨參品種具有豐富的遺傳多樣性。

遺傳相似性分析與基于遺傳距離的聚類分析及主坐標(biāo)分析顯示，12個(gè)黨參品種遺傳距離與地理位置分布有著明顯的相關(guān)性。四川省的6個(gè)黨參品種遺傳距離較遠(yuǎn)，形成1支，且品種間的遺傳距離很近，相似性高；道真洛龍黨參與重慶黨參品種遺傳相似性最高，與湖北黨參品種間的遺傳相似性次之，與四川省的黨參品種遺傳相似性最低。張建清等利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)技術(shù)分析甘肅栽培黨參的遺傳多樣性時(shí)，也發(fā)現(xiàn)黨參栽培居群的遺傳距離與地理分布呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[12]，這可能與地域間基因的流動(dòng)受限有關(guān)，也與大面積黨參種植采用種根繁殖有關(guān)， 影響了黨參種質(zhì)的遺傳多樣性。因此，建議在今后的黨參育種過程中，考慮開展不同優(yōu)良品種中種群間的雜交育種，以獲得更廣泛的遺傳基礎(chǔ)，培育出優(yōu)良的新品種。

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