李在建， 王　旭， 龍良啟， 操繼躍

(1.聊城大學農學院，山東聊城 252000；2.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢 430070)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是豬呼吸道常在的一種NAD依賴的革蘭氏陰性菌，屬于巴氏桿菌科[1]，顯微鏡下觀察為多種形態(tài)的桿狀細菌。在某些特殊環(huán)境下能入侵機體，從而引發(fā)豬的漿液性或纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎、腦膜炎等，俗稱格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)[2-3]或引起豬的急性敗血癥[4]。副豬嗜血桿菌病主要影響2周～4月齡的豬，常在仔豬保育階段發(fā)病，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴重時死亡率高達50%。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模的迅速擴大和養(yǎng)殖模式的改變，近些年流行趨勢日趨嚴重，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的主要細菌性病原，造成了大量的經濟損失[5-7]。唾液酸作為細菌代謝中一種重要的分子，一方面可以作為細菌的能量供細菌生存所需，另一方面細菌又可以利用唾液酸作為自己的結構物質與宿主細胞相互作用。

本研究以副豬嗜血桿菌的nanH基因為研究對象，研究副豬嗜血桿菌不同標準菌株中nanH序列的差異及神經氨酸酶活性的不同；同時第一次通過大腸桿菌原核表達獲得有活性的神經氨酸酶。

1　材料與方法

1.1　載體與質粒

原核表達載體載體pET-28a(+)和pET-32a(+)購自Invitrogen公司。

1.2　工具酶及主要試劑

所有的限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、高保真酶Pyrobest DNA Polymerase 均購自大連寶生物公司(TaKaRa)。

PCR產物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒均為Omiga產品。

BL21(DE3) pLysS感受態(tài)細胞、質粒小提試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

胰酶大豆瓊脂(TSA)、胰酶大豆瓊脂(TSB)均購自Difco公司。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)購自中國上?；瘜W試劑公司。

瓊脂糖、胰蛋白胨以及酵母浸出物等購自OXOID公司。

神經氨酸酶檢測試劑盒購自碧云天生物制品公司。

1.3　重組質粒的構建

nanH全長PCR純化回收產物酶切體系(總體積50.0 μL)見表1。載體pET-28a(+)酶切體系(總體積 50.0 μL)見表2。

表1　nanH全長PCR純化回收產物酶切體系

表2　載體pET-28a(+)酶切體系

載體pET-32a(+)酶切體系(總體積50.0 μL)見表3。

表3　載體pET-32a(+)酶切體系

純化回收的PCR酶切產物與質粒載體的連接反應體系(總體積20.0 μL)見表4。

表4　純化回收的PCR酶切產物與質粒載體的連接反應體系

所有組分加完后，使用移液器充分混勻，置于22 ℃溫箱中連接過夜。取10.0 μL連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，小量制備質粒，鑒定正確的質粒-20℃保存。

1.4　神經氨酸酶粘附功能的研究

(1)使用接種環(huán)將副豬嗜血桿菌0165均勻接種于TSA V.S. 平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h，使用無菌5 mL PBS將細菌洗下來，5 000 r/min離心5 min，收集菌體。盡量棄凈上清，使用1 mL DMEM細胞生長液重懸，并取相應量按1 ∶100比例用生長液稀釋。(2)從CO2培養(yǎng)箱中取出提前1 d接好的24孔板的細胞，觀察細胞形態(tài)。棄掉每孔的生長液，使用PBS洗滌細胞2次。(3)將細菌懸液加入到細胞板中(MOI=100)，陰性對照每孔加入20 μL空載體破碎后上清，樣品組加入神經氨酸酶樣品，室溫4 000 r/min離心10 min，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h。(4)取出細胞板，使用PBS洗2次，每孔加入100 μL胰酶將細胞消化，每孔加入100 μL細胞裂解液，然后加入900 μL PBS補足至1 mL，反復吹打至細胞完全裂解。(5)細胞裂解產物取10-1、10-22個稀釋度涂平板計數(shù)。

2　結果與分析

2.1　不同細菌間nanH基因序列比較結果

將nanH基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，發(fā)現(xiàn)巴氏桿菌屬中，本試驗測定的副豬嗜血桿菌 SH0165菌株nanH基因序列與多殺性巴氏桿菌(PasteurellamμLtocida)同源性達到60%，與溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)同源性達到58%，與其他非巴氏桿菌屬如產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)同源性達到38%，與索氏梭菌(Clostridiumsordellii)同源性達到34%，與鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimuriu)同源性達到31%。

將15株副豬嗜血桿菌標準血清型菌株的神經氨酸酶(NA)做進化樹分析，結果見圖1。

2.2　副豬嗜血桿菌不同標準血清型神經氨酸酶活性分析

提取副豬嗜血桿菌13株標準株總蛋白后，使所有待測樣品蛋白濃度統(tǒng)一為2.32 μg/μL，在S=60情況下使用BioTeK Synergy HT熒光酶標儀和碧云天神經氨酸酶檢測試劑盒檢測其中神經氨酸酶活性，每個樣品平行3次，熒光檢測結果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)不同血清型副豬嗜血桿菌菌株的神經氨酸酶活性并不相同。

2.3　神經氨酸酶可溶性表達的研究

2.3.1重組表達質粒的構建及鑒定nanH基因全長表達從起始密碼子開始，至終止密碼子結束。因為在設計引物時引入了酶切位點，因此將PCR產物與載體分別酶切后，將nanH基因分別插入表達載體pET-32a中，構建重組表達質粒。用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組表達質粒鑒定，所得條帶與預期一致(圖3)。

2.3.4SDS-PAGE鑒定將重組表達質粒pET-32a-NA轉入BL21(DE3) pLysS原核表達感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆后，18 ℃低溫誘導16 h，集菌破碎后進行SDS-PAGE電泳。由圖4表明，重組表達質粒pET-32a-NA轉化菌株在大小約為80 ku處有1條特異性表達帶，而在pET-32a空載體菌株的相應位置沒有此蛋白帶，證明NA在大腸桿菌BL21(DE3) pLysS中表達在上清，即為可溶性表達。同時，使用神經氨酸酶檢測試劑盒檢測上清樣品，S=70時，3次平行結果為289、271、296，平均值為285，以pET-32a轉化BL21(DE3) pLysS破碎后上清為陰性對照，檢測結果為79、89、71，平均值為79。實際熒光值=陽性值-陰性值，因此實際熒光值為206，結果證明上清中NA有活性。

4　討論

通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌nanH基因高度保守，且在15株標準血清型中其核苷酸同源性高達99.54%，而氨基酸的同源性高達99.29%，證明神經氨酸酶(NA)是副豬嗜血桿菌生存所必需的[6]。通過試驗推測，可能神經氨酸酶并不直接決定副豬嗜血桿菌毒力的高與低，但卻是副豬嗜血桿菌具有毒力所必不可少的條件。

同時，本試驗研究了副豬嗜血桿菌15株標準菌株以及其他一些細菌的神經氨酸酶的核苷酸和氨基酸序列，尋找出副豬嗜血桿菌神經氨酸酶的活性區(qū)域，發(fā)現(xiàn)這些活性區(qū)域高度保守[8]。缺失NA或調節(jié)NA的基因制成弱毒疫苗，或者添加某種抑制劑抑制神經氨酸酶的活性從而降低細菌的毒力，也可以成為未來神經氨酸酶應用于生產實踐的一個方面。

本試驗嘗試使用大腸桿菌原核表達神經氨酸酶，在試驗過程中使用了多種表達載體，如pET-28a、pET-30a、pET-32a、pGEX-KG，轉化BL21(DE3)后神經氨酸酶都以包涵體的形式存在，但在經過包涵體的純化和復性后檢測重組蛋白沒有活性，嘗試了多種包涵體復性的方法，卻一直無法獲得有活性的蛋白。最后經過數(shù)次嘗試，終于將重組質粒轉化BL21(DE3)plysS表達菌株，經過18 ℃低溫誘導16 h后重組蛋白破碎后在上清中，也就是以可溶性表達的形式存在，使用神經氨酸酶檢測試劑盒檢測蛋白有活性[9-10]。但是蛋白表達量較低，使用蛋白純化儀多次純化無法獲得目的蛋白。

神經氨酸酶是唾液酸為副豬嗜血桿菌所利用的第一步，而對于副豬嗜血桿菌更為重要的是唾液酸的代謝。如研究者所說，唾液酸不僅是世界上最有趣的一個分子，更為最重要的一個分子。如前言所述，唾液酸進入細菌后不僅可以作為營養(yǎng)物質為細菌提供碳源和氮源，另一方面唾液酸參與構成細菌表面結構，在細菌與宿主的互作中起到重要的作用，如逃避宿主先天免疫系統(tǒng)的殺傷、促進生物被膜的形成以及提高毒素的毒力[11-12]。因此，研究唾液酸代謝過程的重要性不言而喻。

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