解麗麗，呂洪濤，許瑞雪

（1. 大連市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116033； 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 大連 116011）

絲裂素活化蛋白激酶 （mitogen activated protein kinase，MAPKs） 存在于細(xì)胞中，是在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用的絲/蘇氨酸蛋白激酶。P38蛋白是MAPKs家族中重要的一員，許多生理性與化學(xué)性刺激都能激活P38的磷酸化。JOHNSON等［1］研究發(fā)現(xiàn)，ERK、JNK、磷酸化P38（phosphorylated P38，p-P38）蛋白激酶所參與的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)元可塑性等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。許力等［2］研究發(fā)現(xiàn)，脊髓中的P38與TNF-α活化，抑制P38磷酸化可以減少TNF-α，提示P38可能參與疼痛的中樞敏化。P38廣泛存在于脊髓和背根神經(jīng)節(jié) （dorsal root ganglion，DRG） ，并在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著抗炎作用［3-4］。

慢性背根神經(jīng)節(jié)壓迫 （chronic compression of dorsal root ganglion，CCD） 模型是一種外周神經(jīng)病理性疼痛模型，是研究外周神經(jīng)不完全性損傷的常用動物模型，本研究檢測CCD大鼠DRG中p-P38 表達(dá)情況，探討p-P38在神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

18只SD大鼠 （160～180 g，雌性） 由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心提供。室溫飼養(yǎng)，12 h照明/12 h黑暗，水與鼠糧自由食用。實驗前大鼠要適應(yīng)實驗室環(huán)境1 h。動物使用遵照大連醫(yī)科大學(xué)動物管理委員會要求。大鼠隨機(jī)均分為3組：假手術(shù)組（sham組） 、CCD組、CCD模型SB203580給藥組 （治療組） ，每組6只。分別于術(shù)后14 d測完行為學(xué)取材。

1.2 試劑

P38抑制劑，4-（4-氟苯） -2-（4-甲磺酰苯） -5-（4-吡啶基） -1氫-咪唑 （SB203580，美國Sigma公司） ；內(nèi)參β-actin抗體、p-P38抗體與P38抗體 （美國Cell Signaling公司） 。

1.3 CCD模型制備

大鼠腹腔注射l%戊巴比妥鈉 （40 mg/kg） 麻醉后，用剃毛刀將腰背部的毛剃光，鋪上紙巾暴露出手術(shù)野，沿著右側(cè)脊椎從L2-5切開皮膚、分離肌肉。將“L型” （長3 mm、直徑0.6 mm） 的不銹鋼棒，與背部正中線成30°角，與脊柱側(cè)面水平線成15°。分別插入L3和L4椎間孔，觀察到大鼠右后肢抽動即為插入成功。術(shù)后腹腔注射青霉素預(yù)防感染。鞘內(nèi)置管在CCD手術(shù)前實施，打開L6的硬腦膜，將導(dǎo)管置入大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔，大約位于L3-4，縫合后固定導(dǎo)管，等待大鼠恢復(fù)24 h后再進(jìn)行CCD手術(shù)。

1.4 大鼠機(jī)械疼痛閾值測試

檢測大鼠后足對Von Frey絲 （直徑200 μm） 刺激的縮足反應(yīng)，使用機(jī)械縮足閾值 （paw withdrawal mechanical threshold，PWMT） 衡量機(jī)械疼痛的程度。大鼠放置在1個10 cm×10 cm×15 cm的透明玻璃盒中，底部放置金屬網(wǎng) （0.5 cm×0.5 cm） 。使用Von Frey絲垂直扎大鼠的足底，當(dāng)大鼠后足突然揚足、縮足或舔足反應(yīng)為陽性，每次刺激間隔10 min，每只大鼠重復(fù)測量5次，取平均值。

1.5 大鼠熱痛閾值測試

通過檢測大鼠后足底對熱刺激產(chǎn)生的縮腿動作時間（ paw withdrawal thermal latency，PWTL） 來衡量熱痛閾值。把待檢測的大鼠單獨放置于底部厚為0.22 mm的透明玻璃籠（ 20 cm×20 cm×40 cm） 中，在安靜環(huán)境下適應(yīng)30 min后，使用熱輻射疼痛刺激器（ BME-410C，天津伯爾尼科技有限公司） 在玻璃板下固定距離聚焦大鼠后足底，當(dāng)大鼠產(chǎn)生縮足或舔足停止照射，記錄照射起止的間隔時間。每只大鼠重復(fù)測量5次，間隔時間＞5 min，取平均值作為PWTL。為避免給大鼠足底皮膚造成損傷，設(shè)置最高閾值為20 s。

1.6 Western blotting檢測大鼠DRG神經(jīng)元中p-P38的表達(dá)

所有蛋白取自實驗大鼠L3和L4的DRG。每個樣品總蛋白25 μg，使用10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳，在4 ℃轉(zhuǎn)膜1 h到PVDF上，使用TBST（ 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5，0.15 mol/L NaCl，0.05% Tween-20） 沖洗，共洗3次，每次10 min；接著用含10%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，然后用一抗p-P38抗體（ 1∶500） 4 ℃孵育過夜，第2天用TBST洗3次，每次10 min，之后應(yīng)用二抗（ 1∶1 000） 室溫孵育1 h，使用發(fā)光試劑盒（英國ECL kit公司） 檢測發(fā)光信號。所有實驗使用等量蛋白進(jìn)行P38（ 1∶1 000） 和β-actin抗體（ 1∶2 000）檢測。p-P38和P38的蛋白條帶灰度值用Image J軟件（美國NIH公司） 分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實驗數(shù)據(jù)用±s表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠機(jī)械疼痛行為學(xué)結(jié)果比較

大鼠機(jī)械疼痛行為學(xué)結(jié)果顯示，大鼠在進(jìn)行CCD手術(shù)前對機(jī)械刺激的縮腿反應(yīng)的基礎(chǔ)閾值是20.5 g。與sham組比較，CCD組大鼠的機(jī)械縮腿閾值明顯降低 （P＜ 0.01） ，并表現(xiàn)為時間依賴性，手術(shù)后1、3、5、7 d后持續(xù)降低，但手術(shù)后14 d大鼠的機(jī)械縮腿閾值增加，恢復(fù)近正常。與CCD組比較，治療組大鼠除第1天外，其他時間點的機(jī)械縮腿閾值明顯升高 （P＜ 0.05） 。3組大鼠在手術(shù)后14 d，機(jī)械縮腿閾值都恢復(fù)至正常，沒有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05） 。見表1。

2.2 各組大鼠熱疼痛行為學(xué)結(jié)果比較

表1 3組大鼠對機(jī)械刺激、熱刺激所產(chǎn)生縮足反應(yīng)比較Tab.1 Comparison of the withdrawal response to mechanical stimuli and heat stimuli in the three groups

熱刺激反應(yīng)結(jié)果顯示，大鼠在進(jìn)行CCD手術(shù)前對熱刺激縮腿反射基礎(chǔ)閾值是13 s。與sham組比較，CCD組、治療組大鼠對熱刺激的縮腿反射時間明顯縮短 （均P＜ 0.01） 。鞘內(nèi)注射SB203580不能改變CCD引起的熱痛覺過敏，見表1。

2.3 各組大鼠DRG中p-P38的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，sham組大鼠DRG僅有少量p-P38蛋白表達(dá)。與sham組比較，CCD組大鼠手術(shù)14 d后DRG中p-P38蛋白表達(dá)明顯增加 （P＜0.01） 。與CCD組比較，治療組大鼠手術(shù)14 d后DRG中p-P38蛋白表達(dá)明顯減少 （P＜ 0.01） 。各組大鼠P38蛋白表達(dá)沒有變化。見圖1。

圖1 各組大鼠DRG中p-P38和P38蛋白表達(dá)比較Fig.1 p-P38 and P38 protein expression levels in the DRG of rats

3 討論

p-P38抑制劑是吡啶咪唑衍生物，主要有第一代SB202190、SB203580、SB220025，第二代SB239063等。其中，SB203580是可以通過細(xì)胞的分子，與ATP競爭性結(jié)合P38上的位點而發(fā)揮抑制作用。SB203580抑制P38磷酸化，減少脊髓中TNF-α合成，從而緩解神經(jīng)病理性疼痛［2］。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCD能引起大鼠對機(jī)械與溫度刺激的痛覺異常。提前鞘內(nèi)注射SB203580能夠抑制機(jī)械刺激引起的痛覺異常，對熱刺激引起的痛覺異常沒有作用。PIAO等［6］研究發(fā)現(xiàn)，CCD引起三叉神經(jīng)節(jié)損傷，激活膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞中的p-P38，引起痛覺過敏。因此，SB203580可能在DRG的神經(jīng)元細(xì)胞中具有相似功能，通過抑制P38的磷酸化來保護(hù)DRG中的神經(jīng)元細(xì)胞，防止神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。

胡建雷等［7］報道，脊髓背角中P38磷酸化，能夠引起CCD大鼠的神經(jīng)病理性疼痛。韓光等［8］報道，高壓氧可能通過活化脊髓中的P2X4受體，激活p38 MAPK信號通路，進(jìn)而緩解CCI大鼠的機(jī)械痛與熱痛。近年有學(xué)者［9-10］報道，MAPK信號通路中的P38在炎癥細(xì)胞、應(yīng)激、凋亡和神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示，SB203580注射可以引起大鼠DRG中p-P38蛋白表達(dá)增加。P38只是MAPK信號通路中的作用蛋白，還需要對該信號通路的上下游進(jìn)行深入研究，探討其他蛋白的表達(dá)變化情況。SB203580有可能通過增加p-P38蛋白表達(dá)，從而調(diào)控下游信號通路，引起ERK-κ Bp65磷酸化，發(fā)揮緩解神經(jīng)病理性疼痛的作用。

綜上所述，SB203580能夠減輕CCD所引起的機(jī)械痛，但對CCD所引起的熱痛沒有作用。p-P38蛋白可能是神經(jīng)病理性疼痛的作用靶點，今后有可能指導(dǎo)臨床用于緩解慢性疼痛。

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