張笑笑　徐　威　金　巍　陳　靜　劉明麗　任傳成

(復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　上海　200240)

缺血性腦卒中(ischemic cerebral stroke,ICS)是一種常見(jiàn)的腦血管疾病,具有發(fā)病率高、致死率高及致殘率高的特點(diǎn)。我國(guó)每年新增約250萬(wàn)腦卒中患者,其中ICS患者接近70%[1]。重組組織型纖溶酶原激活物(rt-PA)是急性ICS最有效的治療藥物[2]。然而,這種溶栓藥物存在嚴(yán)格的治療時(shí)間窗限制,僅有少數(shù)ICS患者能得到有效的治療[3]。ICS的臨床診斷主要借助CT和MRI,但影像學(xué)診斷并非絕對(duì)可靠,所以有必要尋找ICS生物標(biāo)志物協(xié)助早期診斷。

蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種高通量篩選鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù),為尋找ICS生物標(biāo)志物提供了新的可能。雖然,腦卒中領(lǐng)域蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道,但是腦缺血后腦皮層蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化研究甚少。本研究首次采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag,TMT)標(biāo)記技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜,探討大鼠ICS后腦皮層蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,旨在通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法深入揭示腦缺血對(duì)皮層蛋白質(zhì)表達(dá)變化的影響,為尋找ICS生物標(biāo)志物及進(jìn)一步闡明ICS的病理生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組42只清潔級(jí)成年雄性SD大鼠,體重280～330 g,由上海獸醫(yī)研究所提供及飼養(yǎng)。分為假手術(shù)組(sham組,n=12)和腦缺血組(ICS組,n=30),ICS組按照缺血時(shí)間不同進(jìn)一步分為缺血1、6、24、48 h (表1)。動(dòng)物飼養(yǎng)及手術(shù)按照復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)范執(zhí)行。

模型構(gòu)建及取材采用異氟烷麻醉,大鼠置于操作臺(tái)上,行頸部正中切口并分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,穿線待用。切開(kāi)左側(cè)顳部肌肉并磨去部分顳骨,在體視顯微鏡下用注射器針頭挑開(kāi)腦膜并暴露大腦中動(dòng)脈。使用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,電凝左側(cè)大腦中動(dòng)脈,雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉30 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾?？p合手術(shù)切口,并于缺血后1、6、24、48 h處死大鼠,取左側(cè)腦皮層組織。Sham組的大鼠進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈的分離,但不進(jìn)行夾閉和電凝栓塞,并于術(shù)后48 h取腦皮層組織。將以上腦組織樣品保存于-80 ℃,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況Tab 1　Grouping of experimental animals　(n)

TTC染色取sham組和ICS 48 h組的大鼠,水合氯醛腹腔注射麻醉,于左心室灌入500 mL生理鹽水,斷頭取腦,于腦片槽中制成2 mm冠狀切片。將腦冠狀快速切片置于1% TTC 染液中,避光孵育30 min,置于多聚甲醛中固定20 min,用掃描儀對(duì)固定后的切片進(jìn)行掃描。

Westernblot實(shí)驗(yàn)取等量腦組織加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酯酶抑制劑的RIPA裂解液中裂解,勻漿提取蛋白質(zhì),BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5% 脫脂牛奶封閉2 h,加入兔抗-熱休克蛋白27 (heat shock protein 27,HSP27)的抗體(1∶1 000,英國(guó)Abcam公司),4 ℃孵育過(guò)夜,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶4 000,美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司),4 ℃孵育2 h,加入發(fā)光液顯影,在Bio-Rad自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中拍照,以β-actin為內(nèi)參。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析每組腦組織樣品取100μg進(jìn)行還原,烷基化,胰蛋白酶酶解,TMT試劑標(biāo)記,采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離鑒定。原始文件采用MaxQuant 1.5.2.8軟件在Uniprot rat蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索,用MaxQuant軟件自帶算法鑒定多肽及蛋白質(zhì),并給出TMT定量信息。肽和蛋白質(zhì)誤差設(shè)置為0.1。采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

結(jié)　　　果

腦組織TTC染色選擇ICS 48 h組的原因是腦缺血48 h后腦TTC染色最穩(wěn)定。TTC染色結(jié)果顯示大鼠ICS模型建造成功(圖1)。

質(zhì)譜結(jié)果分析將4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ICS組分別與sham組比較,共獲得25個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。這25個(gè)蛋白質(zhì)滿足以下條件:所有時(shí)間點(diǎn)ICS組與sham差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且至少1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)倍數(shù)大于5 (表2)。

A:Sham group;B:ICS 48 h group.White indicates infarction zone;red indicates normal tissue.No ischemic lesion was observed in the sham group.Arrowhead showed left cerebral cortex tissue.

圖1　大鼠腦皮層組織TTC染色圖Fig 1　TTC staining image of brain cortex tissues in rats

Two-group comparison was analyzed byttest.(1)ICS groupvs.sham group,P<0.05.

色譜圖和質(zhì)譜圖分析HSP27和補(bǔ)體C3的色譜圖顯示基峰窄、時(shí)間短,提示色譜分離蛋白質(zhì)的效果較好(圖2A、B)。HSP27和補(bǔ)體C3的質(zhì)譜圖顯示肽段b離子和y離子信息豐富,提示質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的效果較好(圖2C、D)。

生物信息學(xué)分析對(duì)25個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行Gene Ontology富集分析,按照蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過(guò)程分類(圖3A),差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要富集在急性期反應(yīng)(P<0.001)、炎癥反應(yīng)(P<0.001)、脂蛋白代謝過(guò)程(P<0.001)、補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑(P=0.001)和固有免疫反應(yīng)(P=0.005);按照蛋白質(zhì)所屬的細(xì)胞組分分類(圖3B),差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞外隙(P<0.001)、細(xì)胞外泌體(P<0.001)、胞外區(qū)(P<0.001)、細(xì)胞表面(P=0.007)和細(xì)胞外基質(zhì)(P=0.042)。

A:Base peak of HSP27;B:Base peak of complement C3;C:MS/MS of HSP27;D:MS/MS of complement C3.

圖2HSP27和補(bǔ)體C3的基峰及質(zhì)譜分析
Fig2BasepeakandMS/MSofHSP27andcomplementC3

圖3　25個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析Fig 3　Bioinformatics analysis of 25 differentially expressed proteins

急性期反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)包括C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、T-kininogen 1、T-kininogen 2、血清淀粉樣蛋白A (serum amyloid A protein,SAA)、α-1抗蛋白酶(α-1-antiproteinase)和murinoglobulin-1;炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)包括S100-A8、激肽釋放酶、α-1抗蛋白酶、T-kininogen 1、murinoglobulin-1、α-1抑制因子3、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N和補(bǔ)體C3;脂蛋白代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)包括載脂蛋白C-Ⅰ (apolipoprotein C-Ⅰ,Apo C-Ⅰ)、Apo A-Ⅳ和Apo A-Ⅰ;補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)包括CRP、補(bǔ)體C3及補(bǔ)體C9;固有免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)包括S100-A8、S100-A9、血清淀粉樣P物質(zhì)和纖維蛋白原β鏈。

Westernblot檢測(cè)為了驗(yàn)證定量蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果,我們挑選HSP27進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,生理狀態(tài)下HSP27在腦組織中低表達(dá),但在缺血條件下HSP27可迅速誘導(dǎo)表達(dá),具有較高的靈敏性[4]。Western blot結(jié)果顯示,與sham組比較,腦缺血后1、6、24和48 h,HSP27的表達(dá)均顯著升高,分別是sham組的1.7、1.5、2.1和3.3倍(P<0.05,圖4)。HSP27的表達(dá)變化與定量蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果基本一致。

A:Expression change of HSP27 after cerebral ischemia;B:Relative density of HSP27 normalized to β-actin.(1)vs.sham group,P<0.05.

圖4Westernblot驗(yàn)證定量蛋白組學(xué)的結(jié)果
Fig4ValidationofquantitativeproteomicsresultsbyWesternblot

討　　　論

通過(guò)對(duì)腦皮層蛋白質(zhì)組的研究,我們鑒定到25個(gè)腦缺血后顯著變化的蛋白質(zhì),利用生物信息學(xué)分析將其分為5類。第1類為急性期反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。CRP作為急性期反應(yīng)的特征,也是炎癥反應(yīng)的血液標(biāo)志物。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后血漿CRP的水平顯著升高。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明急性ICS患者預(yù)后與血漿CRP水平呈正相關(guān)[6]。T-kininogen 1和T-kininogen 2是血清糖蛋白,為緩激肽的前體,緩激肽通過(guò)與其受體結(jié)合,激活緩激肽-激肽系統(tǒng),參與腦缺血后神經(jīng)組織損傷[7]。SAA是一種多功能的急性期蛋白質(zhì),參與血小板聚集和黏附,促進(jìn)血栓形成[8]。SAA被報(bào)道可能作為動(dòng)脈粥樣硬化性ICS的診斷依據(jù)[9]。Sezer等[10]發(fā)現(xiàn)急性ICS患者的血清SAA水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)腦缺血后上述蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了顯著變化,由此推測(cè)這些蛋白質(zhì)在腦缺血損傷中發(fā)揮重要作用。murinoglobulin-1具有肽酶抑制活性,在腦缺血領(lǐng)域尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道,值得進(jìn)一步探討。

第2類為炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。S100-A8又稱骨髓相關(guān)蛋白8 (Mrp8),參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,Mrp8可能通過(guò)與Toll樣受體結(jié)合,介導(dǎo)神經(jīng)炎癥,參與腦缺血再灌注損傷[11]。α-1抗蛋白酶又稱 α-1抗胰蛋白酶,是一種保守的絲氨酸蛋白酶抑制劑?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),α-1抗蛋白酶在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮抗炎和抗凋亡的作用[12]。激肽釋放酶是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的主要限速酶,該系統(tǒng)對(duì)于調(diào)節(jié)腦缺血及創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應(yīng)和水腫形成具有十分重要的意義[13]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)上述蛋白質(zhì)在腦缺血后發(fā)生了明顯變化,提示這些炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)與腦缺血損傷密切相關(guān)。α-1抑制因子3和絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N在腦缺血中的作用尚不明確,有待進(jìn)一步研究。

第3類為脂蛋白代謝過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)。本研究共發(fā)現(xiàn)3種Apo在腦缺血后發(fā)生了變化。Apo A-Ⅰ參與膽固醇的反向轉(zhuǎn)運(yùn),可能成為臨床ICS診斷的血液標(biāo)志物[14]。Apo C-Ⅰ可能作為區(qū)分ICS和出血性腦卒中的血漿指標(biāo)[15]。Apo A-Ⅳ在腦卒中領(lǐng)域尚無(wú)相關(guān)研究。由此提示脂蛋白代謝可能參與腦缺血損傷過(guò)程。

第4類為補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體 C3和C9的表達(dá)都發(fā)生了顯著變化,提示腦缺血過(guò)程中發(fā)生了補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。補(bǔ)體激活有3種途徑:經(jīng)典途徑、替代途徑和甘露糖結(jié)合凝集素途徑。補(bǔ)體C3作為這3種途徑的交集,參與小鼠腦缺血再灌注損傷[16]。一項(xiàng)新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)的研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體C9在神經(jīng)元大量沉積,提示補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑參與HIE的發(fā)病[17]。綜上所述,補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑的激活與腦缺血損傷密切相關(guān)。

第5類為固有免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。S100-A8和S100-A9是鈣離子結(jié)合蛋白,除介導(dǎo)炎癥反應(yīng)外,在固有免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中也具有十分重要的意義。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,S100-A8和S100-A9通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫學(xué)功能來(lái)維持胃腸道的穩(wěn)態(tài)[18]。血清淀粉樣P物質(zhì)廣泛存在于脊椎動(dòng)物,與機(jī)體淀粉樣病變有關(guān)。纖維蛋白原β鏈的具體功能尚不明確。

除了上述提及的蛋白質(zhì),本研究還發(fā)現(xiàn)HSP27、血清白蛋白,陰離子交換蛋白、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3L和絲氨酸蛋白酶抑制劑3K的表達(dá)發(fā)生了明顯變化。白蛋白是血漿中最主要的蛋白質(zhì),參與維持血漿膠體滲透壓。臨床試驗(yàn)表明,白蛋白可能作為急性ICS患者神經(jīng)功能持續(xù)惡化的危險(xiǎn)因素[19]。HSP27是一種高度保守的分子伴侶蛋白,參與腦缺血后的神經(jīng)保護(hù),包括緩解皮層損傷[20]及抑制血腦屏障崩解[21],被認(rèn)為是一個(gè)新的腦缺血治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)HSP27在腦缺血后顯著升高,提示HSP27在腦缺血損傷中發(fā)揮重要的作用。陰離子交換蛋白參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞Cl-/HCO3-的跨膜交換,但是其在腦缺血損傷中的作用尚無(wú)報(bào)道。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和絲氨酸蛋白酶抑制劑A3L/3K在腦缺血中的重要性也尚不清楚。這些蛋白質(zhì)在腦缺血中的意義還需進(jìn)一步研究。

我們借助蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲得25個(gè)潛在的ICS生物標(biāo)志物,為ICS的早期診斷及進(jìn)一步闡明ICS的病理生理機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),但是未來(lái)還需要大量臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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