徐士儒，王云霞，連若純，張諝，陳偉洪，何來賓，陳婉如，陳現(xiàn)*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳　518045；2.深圳市福田區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，深圳　518045)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM)是指孕20周前連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，在育齡婦女中發(fā)病率為1%～3%[1]。研究表明，引起RM的病因主要包括遺傳、內(nèi)分泌和解剖結(jié)構(gòu)異常、生殖道感染等，另外還有約40%～50%的患者病因不明[1]。免疫因素在RM的發(fā)生過程中可能起著重要的作用。正常妊娠的維持需要母體對胎兒產(chǎn)生免疫耐受，而免疫因素引起的RM可能是免疫耐受機制被破壞的結(jié)果。自然殺傷細胞(natural killer cell，NK cell)在妊娠免疫機制中起著重要的調(diào)節(jié)作用，與RM中母胎免疫紊亂機制相關(guān)。周圍血CD3-CD56+NK細胞的比例及NK細胞毒性增加可能與RM患者的不良妊娠結(jié)局有關(guān)[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)維生素D對免疫系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用。特別是活性1，25(OH)2D，可抑制T淋巴細胞的增值和分化[4]，能夠促進Th1向Th2型免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)變[5]，以及能夠抑制B細胞的增殖、漿細胞的分化和IgG抗體的分泌[6]。上述研究表明維生素D是一重要的免疫調(diào)節(jié)因子，維生素D缺乏可能參與了某些免疫因素介導(dǎo)的疾病發(fā)生。目前維生素D水平如何影響RM患者外周血NK細胞的數(shù)量和毒性尚不明確。本研究旨在探究RM患者血清中維生素D水平與外周血NK細胞數(shù)量和毒性的關(guān)系，以期為尋找RM的病因和臨床治療策略提供新的方向。

材料與方法

一、研究對象

選取2014年1月至2016年3月首次來本院治療的99例的不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent miscarriage，uRM)患者為研究對象。所有患者均經(jīng)過詳細詢問病史、全身及婦科檢查、染色體核型分析、宮腔感染和宮腔鏡以及內(nèi)分泌等系統(tǒng)性檢查，入選標準為：(1)抗磷脂抗體(如抗β2糖蛋白1抗體、抗心磷脂抗體、抗磷脂酰絲氨酸抗體等)、抗核抗體(抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗Sm抗體等)和抗甲狀腺抗體檢測為陰性；(2)夫婦雙方染色體及胚胎染色體核型分析正常；(3)女方無生殖道感染和生殖道畸形；(4)內(nèi)分泌激素水平正常；(5)未有藥物治療或維生素D補充史。所有患者均在黃體中期首次抽取外周血，并于當天分別檢測維生素D水平，NK細胞比例和NK細胞毒性。

根據(jù)內(nèi)分泌協(xié)會臨床實踐指南，維生素D缺乏為25(OH)D水平<20 ng/ml，維生素D不足為25(OH)D在20～29.9 ng/ml之間，維生素D充足為25(OH)D≥30 ng/ml[7]。因此，本研究的99例RM患者根據(jù)其血清中25(OH)D水平被分為三組，即維生素D正常(vitamin D normal group，VDN)組35例、維生素D不足(vitamin D insufficiency group，VDI)組51例和維生素D缺乏(vitamin D deficiency group，VDD)組13例。維生素D不足和缺乏的患者每天口服0.5 μg的1，25(OH)2D(羅蓋全，上海羅氏制藥有限公司)，時長2個月。64例患者中，1例患者失訪，3例拒絕1，25(OH)2D治療，23例患者在維生素D補充過程中聯(lián)合了其它治療(如淋巴細胞治療)。僅有37例患者為單純1，25(OH)2D治療，其中有2例來自VDD組。考慮到VDD組的樣本過少，因此將維生素D不足和缺乏的患者混合為一組。1，25(OH)2D治療后，再次抽取患者黃體中期的周圍血，并檢測其NK細胞比例和細胞毒性。本研究入選患者均簽署檢測項目和治療知情同意書，實驗流程獲得醫(yī)院學(xué)術(shù)與倫理學(xué)委員會許可。

二、實驗設(shè)備和試劑

1.實驗設(shè)備：ARCHITECT PLUS isR 2000自動化檢測系統(tǒng)(Abbott，美國)，BD FACSCanto II流式細胞儀(Becton Dickinson，美國)。

2.主要實驗試劑：ARCHITECT 25-OH Vitamin D Reagent Kit(Abbott，美國)，BD Multitest 6-color TBNK Reagent Kit(Becton Dickinson，美國)，BD FACS裂解液(Becton Dickinson，美國)，K562細胞株(購自武漢大學(xué)保藏中心)，碘化丙啶(PI，Sigma，美國)，10-壬基溴代吖啶橙染料(DIO，Invitrogen，美國)，淋巴細胞分離液(Axis-Shield，挪威)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen，美國)，新生牛血清(杭州四季青公司，中國)。

三、方法

1.維生素D水平檢測：血清中25(OH)D水平的檢測采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫方法，所有步驟根據(jù)試劑盒說明書完成。

2.外周血NK細胞數(shù)量檢測：采用免疫熒光流式細胞技術(shù)檢測。逆向加樣法加入肝素抗凝血100 μl于Trucount管(Becton Dickinson，美國)中，再分別加入CD45-PerCP、CD3-FITC和CD16/CD56-PE抗體，室溫避光標記15 min，加入經(jīng)10倍稀釋的BD FACS裂解液 2 ml，振勻，室溫避光10 min，樣本充分溶血后用PBS洗滌2次，流式細胞儀進行檢測，并用FACSDiva軟件進行數(shù)據(jù)獲取和分析，計數(shù)CD3-CD16+CD56+NK細胞的比例。

3.NK細胞毒性檢測[8]：抽取患者肝素抗凝血15 ml，用Ficoll密度梯度法分離人外周血單個核細胞(PBMCs)，充分洗滌后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1 × 107/ml備用；同時收集對數(shù)生長期的K562細胞(NK細胞敏感的靶細胞)，加入PBS緩沖液10～20 ml重懸細胞，室溫離心，并進行細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度為1×106/ml；按細胞數(shù)1×106/ml加入3 mmol/L DIO染料，37℃孵育20 min；染色結(jié)束后，將K562細胞懸液用培養(yǎng)液洗滌2次；棄上清，通過細胞計數(shù)用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×105/ml備用；將處理好的PBMCs及K562細胞分別以50∶1、25∶1和12.5∶1的比例混合培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，每個比例設(shè)3個重復(fù)，每孔用培養(yǎng)液補足至200 μl；置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱混合培養(yǎng)4 h；4 h后，在混合培養(yǎng)孔中加入PI對死亡的K562細胞進行染色，流式細胞儀檢測，F(xiàn)ACSDiva軟件進行數(shù)據(jù)分析。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行。治療前各組NK細胞比例和NK細胞毒性采用單因素方差分析；治療前后NK細胞比例和NK細胞毒性變化采用配對t檢驗分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié)　　果

一、RM患者一般資料及維生素D 水平

99例RM患者中，35例(35.4%)患者維生素D水平正常(≥30 ng/ml)，51例患者(51.5%)維生素D不足(20～29.9 ng/ml)，13例(13.1%)為患者維生素D缺乏(<20 ng/ml)。

RM患者的流產(chǎn)次數(shù)和維生素D水平在三組間具有顯著差異，而三組間的年齡、體重指數(shù)(BMI)無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1　RM患者的基線資料及維生素D水平(-±s)

注：與VDN組相比，*P<0.05；與VDI組相比，#P<0.05

二、外周血NK細胞數(shù)量和NK細胞毒性

外周血中CD3-CD56+NK細胞比例在三組間無明顯差異(P>0.05)。三組間的NK細胞毒性情況：與VDN組相比，效靶比(effector-to-target ratio，E∶T)為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細胞毒性在VDI中顯著增加(P<0.05)。而且，E∶T為25∶1和12.5∶1的情況下，NK細胞毒性在VDD和VDN兩組中有顯著差異(P<0.05)。然而，在E∶T為50∶1的情況下，VDI和VDD兩組的NK細胞毒性無顯著差異(P>0.05)(圖1，表2)。

A：三組CD3-CD56+ NK細胞的比例分析；B、C、D：三組效靶比為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細胞毒性，相互比較，*P<0.05圖1　RM患者外周血NK細胞數(shù)量和NK毒性的比較

三、1，25(OH)2D補充對外周血NK細胞數(shù)量和細胞毒性的影響

低維生素D水平的RM患者經(jīng)維生素D治療后，CD3-CD56+NK細胞比例與治療前相比無顯著差異(P>0.05)。NK細胞毒性在三個E：T條件下均顯著降低(P<0.05)(圖2，表3)。

A：治療前后CD3-CD56+ NK細胞的比例分析；B、C、D：治療前后效靶比為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細胞毒性，**P<0.01圖2　1，25(OH)2D對RM患者外周血NK細胞數(shù)量和NK毒性的影響

組別例數(shù)CD3-CD56+NK細胞(%)效靶比(E∶T)50∶125∶112 5∶1VDN3515 7±5 345 3±12 435 8±11 823 0±10 6VDI5117 1±7 051 6±8 8?43 2±9 1?30 2±10 3?VDD1316 4±7 152 3±12 1?45 4±11 9?#32 8±11 0?#

注：與VDN組相比，*P<0.05；與VDI組相比，#P<0.05

表3　1，25(OH)2D對RM患者外周血NK細胞數(shù)量和NK毒性的影響(n=37，-±s)

注：與治療前相比，*P<0.05

討　　論

生殖免疫學(xué)觀點認為，妊娠是一種成功的同種異體移植，認為RM的發(fā)生是同種異體移植失敗。成功妊娠依賴于母體對胎兒產(chǎn)生正確的識別和免疫耐受。NK細胞為異質(zhì)性細胞群體，根據(jù)其表面CD56分子的表達水平主要分為CD56dimCD16+和CD56brightCD16-NK兩個細胞亞群，CD56dimCD16+NK細胞具有較強的殺傷功能，能夠誘導(dǎo)NK細胞的抗體依賴細胞毒性反應(yīng)(ADCC)，對同種異體抗原具有殺傷作用，可在絨毛間隙中直接與絨毛接觸殺傷胚胎[9]。CD56brightCD16-NK細胞主要功能是分泌細胞因子如干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)-β等，殺傷功能較弱。由此可見，NK細胞在妊娠的建立和維持以及胎盤的發(fā)育過程中同樣發(fā)揮著重要作用。文獻報道，RM患者外周血中NK細胞比例和毒性均顯著增加[3]，認為NK細胞數(shù)量的增加是導(dǎo)致RM的一個重要因素[10]。與非妊娠女性比較，早期妊娠的女性其外周血中NK細胞活性顯著降低[3]。這些結(jié)果均表明NK細胞比例和毒性的降低可能能夠抑制母體對胎兒的同種免疫反應(yīng)。

維生素D是維持人體生命所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，機體所需的大部分維生素D可在日光照射下由皮膚內(nèi)的7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)變而來，同時也可以從富含維生素D的食物中獲得。由皮膚生成的和食物來源的維生素D在肝臟中經(jīng)25羥基化酶的催化作用首先生成25(OH)D，血清25(OH)D是血液循環(huán)中維生素D的主要存在形式，常作為評價體內(nèi)維生素D營養(yǎng)狀況的指標。隨后，25(OH)D在腎臟1a羥基化酶的作用下轉(zhuǎn)換為具有活性的1，25(OH)2D，從而促進腸道鈣離子的吸收以及骨代謝[7]。長期以來，人們對維生素D的認識主要集中在對骨代謝的調(diào)節(jié)。自1980年，人們發(fā)現(xiàn)維生素D受體在多種免疫細胞上表達后，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)維生素D對免疫系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用，與多種疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)[11-12]。

近年來越來越多證據(jù)表明維生素D缺乏或不足與婦產(chǎn)科妊娠并發(fā)癥有關(guān)[13]。本研究數(shù)據(jù)表明在RM患者中維生素D缺乏或不足的比例較高，維生素D缺乏或不足的RM患者外周血NK細胞毒性顯著增加。本研究結(jié)果與Ota等[14]報道一致，認為維生素D可參與調(diào)節(jié)RM患者的NK細胞毒性；他們還發(fā)現(xiàn)，維生素D對RM患者NK細胞數(shù)量也有顯著的調(diào)節(jié)作用。然而，本研究結(jié)果表明，與維生素D正常水平的RM患者比較，維生素D缺乏或不足的患者CD3-CD56+NK細胞的比例并沒有顯著變化。這些結(jié)果均表明維生素D可能對RM患者外周血NK細胞毒性起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，推測維生素D對NK細胞數(shù)量和細胞毒性的影響是相互獨立的。維生素D對NK細胞毒性的影響可能與穿孔素和顆粒酶的分泌有關(guān)，而與NK細胞數(shù)量無關(guān)[14]。由此可見，充足的維生素D水平在調(diào)控RM患者外周血NK細胞活性過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果尚表明維生素D的補充對RM患者以上這些異常的細胞免疫反應(yīng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，RM患者經(jīng)過1，25(OH)2D治療后，其外周血所有效靶比條件下的NK細胞毒性均顯著降低。本研究結(jié)果與早期的研究結(jié)果一致[6，15-17]。根據(jù)最近的文獻報道，維生素D能夠促進胞漿中去極化的穿孔素的表達，從而降調(diào)RM患者的NK細胞毒性[12]。但是，目前為止1，25(OH)2D對NK細胞的免疫調(diào)節(jié)機制仍不清楚。

綜上所述，在RM患者中維生素D缺乏或不足具有一定的免疫學(xué)意義。低水平RM患者其外周血NK細胞毒性可能異常增加，而補充1，25(OH)2D后可顯著降調(diào)NK細胞毒性。因此，對具有NK細胞毒性異常增加的RM患者，補充維生素D可作為一種新的輔助治療方案。

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