史曉亞, 高麗霞, 黃登宇

1(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山西 太原, 030006) 2(山西大學(xué),食品藥品快速檢測(cè)中心, 山西 太原,030006)3(山西省食品藥品監(jiān)督管理局, 山西 太原,030006)

硝基呋喃類(lèi)藥物是一類(lèi)人工合成的具有5-硝基呋喃特征環(huán)結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥，包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林[1-3]。由于其抗菌譜廣且不易產(chǎn)生耐藥性，故被廣泛應(yīng)用于禽畜水產(chǎn)養(yǎng)殖中[4-7]。呋喃唑酮經(jīng)動(dòng)物攝取后被迅速代謝，其產(chǎn)物3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone, AOZ)和細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成穩(wěn)定的殘留物[8]，研究表明呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物能使機(jī)體誘變進(jìn)一步致癌，嚴(yán)重影響機(jī)體健康[9-10]，很多國(guó)家禁止使用呋喃唑酮，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第193號(hào)和235號(hào)公告中要求呋喃唑酮及其代謝物在動(dòng)物性食品中不得檢出[11-12]。但由于其抗菌效果好，價(jià)格低廉，仍被非法使用。

目前對(duì)于呋喃唑酮代謝物AOZ的檢測(cè)方法多為儀器法，如高效液相色譜法[13,14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]等，此外還有膠體金免疫層析法[18]、紫外-可見(jiàn)分光光度法[19]、酶免疫分析法[20-22]等。酶免疫分析法屬于安全的免疫學(xué)方法，該法的技術(shù)原理決定了其具有較高的分析靈敏度，常用于動(dòng)物性食品獸藥殘留檢測(cè)中，可用于大量樣品的快速篩查[23]。本研究所建立的酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)[24-25]是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合，再通過(guò)酶底物顯色從而反應(yīng)待測(cè)物含量的定量或定性的酶免疫分析方法，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、不需要昂貴的儀器，能夠用于大批量樣品的快速篩查，并且為AOZ快速檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1　材料與儀器

豬肉，市購(gòu)。

3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)(99.0%)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(≥99%)，N,N’-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)(99%)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(≥97.0%)，卵清蛋白(OVA)(≥98%)，3-(2-硝基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(NPAOZ)(99.7%)(美國(guó)Sigma公司)；AOZ單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗(HRP-IgG)(北京艾旗斯德科技有限公司)；KH2PO4(AR)，Na2CO3(AR)，Na2HPO4·12H2O(AR)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；NaHCO3(AR)(天津市北辰方正化學(xué)試劑廠)；吐溫-20(AR)(天津市光復(fù)化學(xué)試劑廠)。

電子天平 BSA224S，pH計(jì)(PB-10)，德國(guó)Sartorius；超純水機(jī) UPT-I-10T，優(yōu)普純科技有限公司；600 MHz核磁共振儀 BRUKER AVANCE III，德國(guó)Bruker公司；紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1600)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀(NICOLET 380)，美國(guó)Thermo公司；漩渦混勻器 VORTEX GENIUS3，德國(guó)IKA公司；恒溫培養(yǎng)箱(BSD-100)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRD)，瑞士Tecan公司；離心機(jī)(SC-3610)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1合成半抗原3-(4-羧基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(3-{[(4-carboxyphenyl) methylene]amino}-2-oxazolidinone，CPAOZ)(圖1)

稱(chēng)取40.8 mg(0.4 mmol)AOZ溶到1 mL 1 mol/L的HCl中，漩渦混勻讓其快速溶解；稱(chēng)量4-CBA 60 mg(0.4 mmol)溶到1 mL DMF中；將上述兩種溶液混合，室溫條件攪拌反應(yīng)2 d, 之后于4 800 r/min離心25 min, 去掉上清液，乙醇洗滌3次，每次洗滌后于8 000 r/min離心1 min，進(jìn)行烘干并避光保存。

圖1　CPAOZ合成示意圖Fig.1　The synthesis process of CPAOZ

1.2.2包被原CPAOZ-OVA合成

采用活化酯法：稱(chēng)取5.9 mg (25 μmol) CPAOZ，5.1mg (25 μmol) DCC，2.9 mg (20 μmol) NHS溶到1 mL DMF中，室溫下避光反應(yīng)18 h，定為A液；稱(chēng)量11.3 mg (0.25 μmol) OVA溶到1 m LPBS里，定為B液；把A液和B液混合，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，再把此混合液倒入透析袋，并放入PBS緩沖液中于4 ℃透析3 d,每隔8 h換一次透析液，且透析液需提前置于4 ℃冰箱中。透析結(jié)束后移取透析袋中的上清液，并于4 ℃保存用于鑒定。

1.2.3AOZ間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA操作步驟

包被原CPAOZ-OVA用CBS稀釋一定倍數(shù)后，使用酶標(biāo)板按100 μL/孔將其加入并在4 ℃中包被過(guò)夜，用PBST洗液洗板，之后加入200 μL/孔封閉液，37 ℃下進(jìn)行2 h 封閉；洗板拍干操作同上，按照50 μL/孔的量加NPAOZ溶液和50 μL/孔的單克隆抗體，37 ℃下競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)一段時(shí)間；洗板拍干操作同上，按100 μL/孔的量加入稀釋一定倍數(shù)的HRP-IgG，37 ℃下孵育一定時(shí)間；洗板拍干操作同上，按100 μL/孔的量加入顯色底物液，并立即于室溫下避光反應(yīng)即顯色一定時(shí)間；按50 μL/孔的量加入H2SO4終止液，使顯色反應(yīng)終止，使用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的OD值。

1.2.4間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA條件優(yōu)化

1.2.4.1包被原CPAOZ-OVA和單克隆抗體的稀釋倍數(shù)組合

采用棋盤(pán)法，包被原稀釋倍數(shù)依次為400, 800, 1 600, 3 200, 6 400, 12 800, 25 600, 51 200；單克隆抗體稀釋倍數(shù)一次為400，800，1 600，3 200，6 400，12 800。按照2.2.3的步驟操作，測(cè)定吸光度值，封閉液設(shè)為2%脫脂乳，37 ℃下封閉2 h，不添加NPAOZ，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)0.5 h，酶標(biāo)二抗HRP-IgG孵育0.5 h，顯色時(shí)間20 min，每組實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，求平均值，確定吸光度值為1附近的組合為最優(yōu)的包被原和單克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)組合。

1.2.4.2優(yōu)化封閉液濃度、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間、顯色反應(yīng)時(shí)間

配制脫脂乳粉質(zhì)量濃度為5.0、10.0、20.0、30.0 g/L作為封閉液，競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為15、30、60、90 min，HRP-IgG的孵育時(shí)間為15、30、45、60 min，顯色反應(yīng)時(shí)間10、15、20、25 min，操作步驟同2.2.3，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IC50和ODmax/IC50確定最優(yōu)參數(shù)。

1.2.5方法評(píng)價(jià)

(2)特異性。將NPAOZ的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物AOZ、AHD、SEM、AMOZ及其相應(yīng)衍生物NPAHD、NPSEM、NPAMOZ、4-CBA及2-NPA各自配制成同2.2.5(1) 中NPAOZ濃度梯度相同的濃度測(cè)定, 最后求交叉反應(yīng)率CR。

(1)

(3)準(zhǔn)確度和精密度。對(duì)豬肉進(jìn)行酶免疫法的添加回收試驗(yàn)，每一添加濃度做5個(gè)重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV)；重復(fù)檢測(cè)5個(gè)批次，求批間變異系數(shù)，同時(shí)求添加回收率。同時(shí)對(duì)同一批空白豬肉采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，與本研究建立的方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行比較。 樣品前處理操作參照我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3380—2012[26]，同時(shí)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311—2007及GB/T 200752—2006中的HPLC-MS/MS法[27-28]。

(2)

(3)

2　結(jié)果與分析

2.1　半抗原CPAOZ合成鑒定

圖2　CPAOZ的紅外光譜圖Fig.2　The infrared absorbance spectrum of CPAOZ

核磁共振鑒定。進(jìn)一步確定CPAOZ會(huì)否合成成功，對(duì)半抗原CPAOZ的核磁共振1H-NMR圖譜如圖3，13C-NMR圖譜圖4。

圖3　CPAOZ的1H-NMR波譜圖Fig.3　The 1H-NMR of CPAOZ

圖4　CPAOZ的13C-NMR波譜圖Fig.4　The 13C-NMR of CPAOZ

對(duì)二者分析如下：1H NMR(600 Hz, DMSO-d6)：13.068(s, 1H), 8.015(d, 2H), 7.894(s, 1H), 7.842(d, 2H), 4.519(t, 2H), 3.966(t, 2H)；其中，7.894(s, 1H)位置表明合成成功。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) ：167.382, 154.256, 142.886, 138.858, 13.883, 130.272, 127.398, 62.198, 42.638，表明半抗原合成成功。

2.2　包被原CPAOZ-OVA的鑒定

在220～400 nm 范圍內(nèi)對(duì)CPAOZ、OVA、CAOZ-OVA進(jìn)行紫外掃描，譜圖如圖5。其中，CPAOZ的特征吸收峰在292 nm處，OVA吸收峰在279 nm處，CPAOZ-OVA的吸收峰在284 nm處，可見(jiàn)CPAOZ-OVA相對(duì)于CPAOZ和OVA的吸收峰發(fā)生了明顯的偏移，且兼具了后兩者的特征吸收，可初步證明包被原CPAOZ-OVA合成成功。

圖5　CPAOZ-OVA、CPAOZ、OVA的紫外掃描圖Fig.5　The UV spectrum of CPAOZ-OVA, CPAOZ, OVA

2.3　反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1包被原NPAOZ-OVA和單克隆抗體的最優(yōu)稀釋倍數(shù)

包被原NPAOZ-OVA和單克隆抗體按棋盤(pán)法組合測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　包被原和單克隆抗體棋盤(pán)法稀釋倍數(shù)組合下的OD值Table 1　The OD values of different dilution of coatingantigen and monoclonal antibody by checkerboardmethod combination

當(dāng)包被原和單克隆抗體稀釋倍數(shù)各自擴(kuò)大時(shí)，吸光度值表現(xiàn)為降低趨勢(shì)。在ELISA法中，當(dāng)OD值接近于1時(shí)反應(yīng)的靈敏度較高。因此確定包被原CPAOZ-OVA和單克隆抗體稀釋倍數(shù)分別為800倍和6 400倍時(shí)為最佳，同時(shí)與包被原稀釋倍數(shù)和單克隆抗體稀釋倍數(shù)分別為800、3 200時(shí)的OD值1.018相比，前者的抗體倍數(shù)大點(diǎn)，可節(jié)省單克隆抗體的使用成本。故選擇包被原CPAOZ-OVA和單克隆抗體稀釋倍數(shù)分別為800倍和6 400倍。

2.3.2封閉液濃度、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、HRP-IgG孵育時(shí)間和顯色時(shí)間優(yōu)化

不同脫脂乳質(zhì)量濃度下的IC50和ODmax/IC50數(shù)據(jù)見(jiàn)圖6 ，當(dāng)脫脂乳粉質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，IC50的值最小，且ODmax/IC50最大；當(dāng)濃度為20 g/L時(shí)，IC50較小且ODmax/IC50較大時(shí)靈敏度較高，故選脫脂乳質(zhì)量濃度為10 g/L為最佳封閉液質(zhì)量濃度。不同競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、HRP-IgG孵育時(shí)間和顯色時(shí)間的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖7～圖9，同理可得出競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為60 min、HRP-IgG孵育時(shí)間為45 min、顯色時(shí)間為15 min為最佳條件。

圖6　ELISA法脫脂乳粉質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.6　Optimization of skim milk powder concentrationfor ELISA

圖7　ELISA法競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.7　Optimization of competitive reaction time for ELISA

圖8　ELISA HRP-IgG孵育時(shí)間優(yōu)化Fig.8　Optimization of HRP-IgG incubating time for ELISA

圖9　ELISA底物顯色時(shí)間的優(yōu)化Fig.9　Optimization of substrate colouration time for ELISA

2.4　方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1靈敏度

按最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖10，該方法的線性方程是Y=-0.253X+1.336(R2=0.995)，半數(shù)抑制濃度IC50是2.015 ng/mL，線性范圍在0.131～30.911 ng/mL之間。

圖10　AOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10　Standard curve of AOZ

2.4.2特異性

由表2知，本研究中建立的酶聯(lián)免疫法NPAOZ的其他結(jié)構(gòu)相似物及衍生化試劑2-NPA、4-CBA的CR都小于0.1%，說(shuō)明AOZ單克隆抗體的特異性較好，檢測(cè)中不容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)[29]。

2.4.3準(zhǔn)確度及精密度

對(duì)空白豬肉樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),樣品經(jīng)前處理后, 用所建立的ELISA法進(jìn)行檢測(cè), 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.添加回收率在84.8%～90.3%間，批內(nèi)CV在3.3%～4.1%，批間CV在4.6%～6.7%。HPLC-MS/MS法對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖11，線性擬合后的方程是Y=42.82X+18.12(R2=0.999)。添加回收率結(jié)果見(jiàn)表4，其回收率在84.4%～95.4%，CV在3.0%～10.1%。通過(guò)比較表4數(shù)據(jù)可看到，HPLC-MS/MS法的添加回收率比ELISA法高，表現(xiàn)出儀器檢測(cè)法的準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢(shì)，但兩種方法結(jié)果均在85%～115%范圍內(nèi)，表明本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA法的準(zhǔn)確性、精密度和重現(xiàn)性均良好[29], 符合獸藥殘留檢測(cè)分析的要求。

表2　特異性測(cè)定結(jié)果Table 2　Determination results of specificity

表3　酶免疫法準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定結(jié)果Table 3　Results for accuracy and precision forImmunal enzyme methods

圖11　AOZ 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.11　Standard curve of AOZ by HPLC-MS/MS

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)活化酯法成功合成了包被原CPAOZ-OVA，并對(duì)包被原和單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)、反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定此方法的IC50是2.015 ng/mL，線性范圍在0.131～30.911 ng/mL，滿(mǎn)足相關(guān)限量要求。通過(guò)方法學(xué)評(píng)價(jià)得到此方法特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性、精密度和重現(xiàn)性均良好。與劉婷婷[30]建立的呋喃唑酮及其代謝物酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(間接法IC50為2.0 ng/mL，直接法IC50為2.8 ng/mL，回收率在76%～109%之間)靈敏度相當(dāng)，準(zhǔn)確度有所提高，與閔成軍[31]建立的豬肉中呋喃唑酮代謝物殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(變異系數(shù)4.7%～10.3%)相比有顯著提高，說(shuō)明此方法的精密度較好。本研究建立的ELISA法檢測(cè)限與HPLC-MS/MS比有一定差距，但都符合獸藥殘留檢測(cè)分析的要求。可用于動(dòng)物源性食品中呋喃唑酮代謝物的快速篩查。

表4　HPLC-MS/MS法準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果Table 4　The results of accuracy for HPLC-MS/MS

[1]王明明, 許娜, 唐云, 等. 食品中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2016(8):2 202-2 207.

[2]祝偉霞, 劉亞風(fēng), 梁煒. 動(dòng)物性食品中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留檢測(cè)研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010,31(2):99-102.

[3]KONG De-yong, LIANG Bin, YUN Hui, et al. Electrochemical degradation of nitrofurans furazolidone by cathode:Characterization,pathway and antibacterial activity analysis[J]. Chemical Engineering Journal,2015,262:1 244-1 251.

[4]NI Y, WANG P, KOKOT S. Voltammetric investigation of DNA damage induced by nitrofurazone and short-lived nitro-radicals with the use of an electrochemical DNA biosensor[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2012,38(1):245-251.

[5]SAMSONOVA J V, DOUGLAS A J, COOPER K M, et al. The identification of potential alternative biomarkers of nitrofurazone abuse in animal derived food products[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(5):1 548-1 554.

[6]LAURENSEN J J, NOUWS J F. Simultaneous determination of nitrofuran derivatives in various animal substrates by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 1989, 472(1):321-326.

[7]尹玉云. 硝基呋喃類(lèi)抗菌素代謝物免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的建立[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué), 2014.

[8]COOPER K M, KENNEDY D G. Stability studies of the metabolites of nitrofuran antibiotics during storage and cooking.[J]. Food Additives & Contaminants, 2007, 24(9):935-942.

[9]蔣原, 丁濤, 沈崇鈺, 等. 液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)蜂蜜中四種硝基呋喃類(lèi)代謝物[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2005(3):12-15.

[10]BARTEL L C, MONTALTO D M M, CASTRO J A. Nitroreductive metabolic activation of some carcinogenic nitro heterocyclic food contaminants in rat mammary tissue cellular fractions.[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(1):140-144.

[11]農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告-4—2002食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單[S].

[12]農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告-12—2002動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

[13]曹鵬, 耿金培, 尹大路,等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中的呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮藥物殘留量[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 41(3):424-427.

[14]郝征紅, 張炳文, 鄧立剛,等. 高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中呋喃唑酮?dú)埩袅康姆治鲅芯縖J]. 現(xiàn)代食品科技, 2006, 22(1):119-120.

[15]馬駿, 羅華明, 張玲茜. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 57(4):558-562.

[16]宋利軍, 于暉, 程鑫,等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物性食品中硝基呋喃代謝產(chǎn)物的殘留[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2017(3):321-323.

[17]邢麗紅, 李兆新, 孫偉紅,等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)藥物的殘留量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2017, 8(4):1 233-1 239.

[18]周克楠, 唐勇, 藍(lán)彩鳳, 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體及其新型免疫層析檢測(cè)試紙條的制備[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2014(7):927-931.

[19]廖峰, 高慶軍, 林順全. 分光光度法測(cè)定飼料中的呋喃唑酮[J]. 飼料研究, 2003(1):29-30.

[20]任海濤, 沈玉棟, 徐振林, 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附分析方法[J]. 分析化學(xué), 2012(5):745-751.

[21]戴盡波, 徐振林, 劉鳳銀, 等. 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析測(cè)定魚(yú)肉中呋喃它酮代謝物方法研究[J]. 分析化學(xué), 2015(6):871-875.

[22]文永佳, 張峰, 杜幸潔, 等. 呋喃唑酮代謝物分子印跡聚合物的合成及其酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法的建立[J]. 應(yīng)用化工, 2013(7):1 347-1 350.

[23]王碩. 酶聯(lián)免疫吸附分析方法[M]. 北京：科學(xué)出版社, 2011:38-39.

[24]余華, 嚴(yán)玉寶, 謝晶,等. 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及其在進(jìn)出口動(dòng)物產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2010, 37(11):76-79.

[25]徐偉, 程鳳科, 孟銀,等. 酶聯(lián)免疫吸附法在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)家禽, 2013, 35(12):49-50.

[26]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 3380—2012 出口動(dòng)物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法[S]

[27]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局 GB/T 21311—2007 動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法[S]

[28]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局GB/T 200752—2006 豬肉、牛肉、豬肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]

[29]王碩. 酶聯(lián)免疫吸附分析方法[M]. 北京：科學(xué)出版社, 2011:38-39.

[30]劉婷婷. 呋喃唑酮及其代謝物酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究[D]. 天津：天津科技大學(xué), 2010.

[31]閔成軍, 羅曉琴, 汪善良,等. 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)豬肉中呋喃唑酮代謝物殘留[J]. 肉類(lèi)研究, 2011(12):29-32.