王靈昭，史辰娟，汪維喜，蘇琳，王紀豐，邱春江，舒留泉，姚興存

1 (淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室/海洋生命與水產(chǎn)學院, 江蘇 連云港, 222005) 2 (連云港西墅物產(chǎn)有限責任公司, 江蘇 連云港, 222042)

多糖降解產(chǎn)物具有增強免疫、抗腫瘤、降血糖、降血壓、增強機體免疫等生理作用[1]，尤其是其分子質(zhì)量小這一優(yōu)點能夠克服大分子多糖溶解性差、生物利用率低的不足[2]。干紫菜含25%～50%的蛋白質(zhì)(藻膽蛋白占紫菜干重的4%左右)，20%～40%的糖類[3-4]。因此，紫菜的高值化利用應重點關注藻膽蛋白和多糖。王靈昭等[5]提出了一種以鮮紫菜為原料，同時制備藻膽蛋白和多糖的新技術，但該技術體系產(chǎn)生大量水不溶性紫菜多糖。氧化劑的活性基團能奪取多糖β-1，4糖苷鍵1位或4位上的質(zhì)子，使糖苷鍵發(fā)生非酶氧化斷裂而產(chǎn)生水溶性多糖，其中過氧化氫是常用的氧化劑[6]。因此，本文探究前述水不溶性紫菜多糖的過氧化氫降解，期望為高值化開發(fā)條斑紫菜過程中產(chǎn)生的水不溶性多糖的高值化利用提供研究基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

條斑紫菜(Porphyrayezoensis)：由連云港西墅物產(chǎn)有限責任公司提供。試劑純度為分析級或更高級。

1.2　儀器與設備

PS100型平板式離心機，張家港市樂余潤捷機械廠；MTK 662型斬拌機，馬多(北京)機械制造有限公司；CMD2000/4高剪切研磨分散機，切可(上海)機械設備有限公司；MS1001L2K高壓均質(zhì)機，意大利GEA Nliro Soavi公司；CR-22N流體離心機，日本日立儀器有限公司；多用途臺式高速冷凍離心機，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Agileng1200高效液液相色譜儀，安捷倫科技有有限公司；Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測器，美國格瑞斯公司；Nexus-870傅立葉變換紅外光譜儀，美國NICOLET公司；769YP-15A壓片機，北京天創(chuàng)尚邦儀器有限公司；Lambda35紫外/可見分光光度計，美國Perkin Elmer公司。

1.3　實驗方法

1.3.1水不溶性條斑紫菜多糖的制備

參照王靈昭等[5]的前期研究，制備水不溶性條斑紫菜多糖的技術路線如圖1所示。

圖1　制備藻膽蛋白和多糖的技術路線Fig.1　Technical route for preparing phycobiliproteinsand polysaccharides

將采收的紫菜離心脫水后于-20 ℃下凍藏備用。將凍藏紫菜斬拌，加入pH 8.0的KH2PO4-NaOH緩沖液(緩沖液與紫菜質(zhì)量比為1∶1)于40 ℃下溶脹9 h，用高剪切研磨分散機超微粉碎后加水稀釋(物料與水質(zhì)量比為1∶1)，然后于80 MPa下高壓均質(zhì)。將均質(zhì)后的物料用流體離心機離心，獲得的沉淀物即為水不溶性紫菜多糖，用于過氧化氫降解研究。

1.3.2過氧化氫降解紫菜多糖的影響因素研究

1.3.2.1過氧化氫濃度對多糖降解的影響

加水分散水不溶性紫菜多糖，使其干物質(zhì)含量至2%，然后加入體積分數(shù)30%的雙氧水使體系的過氧化氫質(zhì)量分數(shù)分別達到1.2%、1.5%、1.8%、2.1%和2.4%。密閉反應容器使體系在60 ℃下反應6 h，冷卻至室溫，離心得上清液，分析上清液中的總糖含量。

1.3.2.2溫度對多糖降解的影響

加水分散水不溶性紫菜多糖，使其干物質(zhì)含量至2%，然后加入30%的雙氧水使體系的過氧化氫質(zhì)量分數(shù)達到1.8%。體系分別在40、50、60、70和80 ℃下反應6 h，冷卻至室溫，離心得上清液，分析上清液中的總糖含量。

1.3.2.3時間對多糖降解的影響

加水分散水不溶性紫菜多糖，使其干物質(zhì)含量至2%，然后加入30%的雙氧水使體系的過氧化氫質(zhì)量分數(shù)達到1.8%。體系在60 ℃下分別反應4、5、6、7和8 h，冷卻至室溫，離心得上清液，分析上清液中的總糖含量。

以溶出率為指標衡量水不溶性紫菜多糖的過氧化氫降解，其定義為上清液中總糖含量占所消耗的水不溶性紫菜多糖中干物質(zhì)含量的百分比。

1.3.3產(chǎn)物中低聚糖組分分析

將上清液樣品真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/5，用4倍體積的體積分數(shù)95%乙醇醇沉12 h，離心處理去除上清液。添加少量丙酮搖勻后重復上述操作，再加無水乙醇重復上述操作。然后，樣品置通風櫥中通風30 min，于45～55 ℃下干燥后將粉狀樣品置于干燥器中備用。

稱取0.5～2 g粉狀樣品(精確至0.000 1 g)，加入超純水至15 mL后充分混勻，然后加入等體積的質(zhì)量分數(shù)1.5%磺基水楊酸以沉淀蛋白，混勻后靜置、離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后用于粉狀樣品中的單糖及低聚糖分析。參考張媛媛等[7]的研究，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法分析粉狀樣品中的單糖及低聚糖。取葡萄糖、麥芽糖和乳糖作為對照品，色譜條件做如下修改：ZORBAX NH2色譜柱，柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流動相為V(乙腈)∶V(水)=70∶30，流速1 mL/min； 蒸發(fā)光散射器參數(shù)：漂移管溫度80 ℃，N2流速2.0 L/min。

1.3.4產(chǎn)物的紅外光譜分析

1.3.3中所述的粉狀樣品的紅外光譜分析采用KBr壓片法，將薄片進行4 000～400 cm-1范圍的掃描。

1.3.5產(chǎn)物的紫外光譜、蛋白質(zhì)含量及總糖含量分析

將1.3.3中所述的粉狀樣品配成0.05 g/L樣液，然后進行200～400 nm的紫外掃描儀掃描。采用Bradford法測定粉狀樣品的蛋白質(zhì)含量，并分析其總糖含量。

1.3.6化學及統(tǒng)計分析

2　結(jié)果與討論

2.1　過氧化氫降解紫菜多糖的影響因素研究

2.2.1過氧化氫體積分數(shù)對多糖降解的影響

由圖2可知，過氧化氫質(zhì)量分數(shù)1.8%時溶出率顯著地(p<0.05)高于其他濃度下的溶出率。隨著過氧化氫質(zhì)量分數(shù)的增加，溶出率在1.8%時增至最大而后減小，這種過氧化氫質(zhì)量分數(shù)對多糖溶出的影響趨勢與PIERCE等的報道類似。不同糖單體及其構成的糖苷鍵對過氧化氫處理的敏感性不同，過氧化氫質(zhì)量分數(shù)的增加會導致化學強度高的糖苷鍵斷裂，但也會引起敏感單體的降解，因此過氧化氫降解多糖時存在最適的過過氧化氫質(zhì)量分數(shù)[6]。圖2表明，最適的為1.8%。

圖2　過氧化氫質(zhì)量分數(shù)對多糖降解的影響Fig.2　Effect of hydrogen peroxide concentration onpolysaccharide degradation注：標有不同字母的指標值具有顯著性差異(p<0.05)。圖3、圖4同。

2.2.2溫度對多糖降解的影響

由圖3可知，不超過60 ℃時，溶出率隨著溫度的增加而顯著增加(p<0.05)；70 ℃的溶出率與60、80 ℃的溶出率比較，分別呈不顯著增加(p>0.05)和顯著增加(p<0.05)。過氧化氫作用下的溫度過高會導致多糖過度降解，產(chǎn)生非糖類產(chǎn)物，通過降低總糖測定值而降低溶出率。綜合考慮，最適溫度為60 ℃。不同多糖過氧化氫降解的最適溫度不同，本研究的最適溫度與WU等[8]報道的凝膠多糖過氧化氫降解的最適溫度相同。

圖3　溫度對多糖降解的影響Fig.3　Effect of temperature on polysaccharide degradation

2.2.3時間對多糖降解的影響

由圖4可知，隨著時間的增加，溶出率先增加后降低，在6 h時達到最大值；6 h的溶出率顯著大于(p>0.05)其他時間下的溶出率。時間過長，降解液中產(chǎn)生一些非糖類化合物而降低溶出率。綜合考慮，最適時間為6 h。

圖4　時間對多糖降解的影響Fig.4　Effect of time on polysaccharide degradation

2.2　產(chǎn)物中低聚糖組分分析

如圖5所示，圖5-A、5-B和5-C分別是對照品(葡萄糖、麥芽糖)、對照品(乳糖)和降解物樣品的色譜圖。由圖5-A、圖5-B可知，葡萄糖、麥芽糖、乳糖的保留時間分別為10.597、12.874和13.773 min；由圖5-C可知，降解物樣品在13.857、16.883和18.028 min處出峰。本研究采用磺基水楊酸法對粉狀樣品進行了除蛋白預處理，因此圖5-C中的組分應是糖類物質(zhì)。氨基柱已成功用于低分子質(zhì)量糖分析，乙睛-水作為流動相時，出峰順序為單糖、雙糖和較高聚合度的低聚糖[7]。由圖5可知，產(chǎn)物中保留時間13.857 min的組分可能為雙糖衍生物，而保留時間16.883、18.028 min的2種低聚糖組分在聚合度上不低于3，有關結(jié)構信息需深入研究。王靈昭等[9]已報道紫菜多糖的酸水解，比較可知，紫菜多糖酸水解產(chǎn)物組分單一[9]，而過氧化氫降解產(chǎn)物組分多、分子質(zhì)量大。

圖5　對照品(A和B)和降解物樣品(C)的高效液相色譜Fig.5　High performance liquid chromatography of controlsamples (A and B) and hydrolysate sample (B)

2.3　產(chǎn)物的紅外光譜分析

圖6　紅外光譜Fig.6　Infrared spectrum

2.4　產(chǎn)物的紫外光譜、蛋白質(zhì)含量及總糖含量分析

由圖7可知，在260～280 nm有明顯吸收峰，說明樣品含有蛋白質(zhì)。采用Bradford法測定樣品的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明粉狀樣品含有蛋白質(zhì)(2.12±0.06)%。該結(jié)果驗證了紅外光譜1 657 cm-1處是肽鍵上酰胺羰基吸收峰，樣品含有蛋白質(zhì)，且蛋白質(zhì)含量低于紫菜多糖酸水解的樣品蛋白質(zhì)含量(6.88±0.07)%[9]。此外，粉狀樣品含有總糖(93.66±0.51)%。

圖7　紫外光譜Fig.7　Ultraviolet spectrum

3　結(jié)論

研究了過氧化氫降解水不溶性紫菜多糖的影響因素，以及產(chǎn)物的低聚糖組成、紅外光譜、紫外光譜、蛋白質(zhì)含量和總糖含量。結(jié)果表明，多糖降解的最適條件為：過氧化氫質(zhì)量分數(shù)1.8%，溫度60 ℃，時間6.0 h。液相色譜分析表明產(chǎn)物包含3種低聚糖組分，可能為雙糖、雙糖衍生物或聚合度不低于3的低聚糖。紅外光譜分析表明產(chǎn)物主要是β-糖苷鍵連接的吡喃型低聚糖，具有硫酸基和3,6-內(nèi)醚半乳糖結(jié)構。紫外光譜分析表明產(chǎn)物含有蛋白質(zhì)，進一步分析表明產(chǎn)物含有蛋白質(zhì)2.12%、總糖93.66%。研究結(jié)果對水不溶性條斑紫菜多糖的高值化利用具有重要指導價值。

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