李春霞，劉偉，陳凌云，姜文儀，蔣光月，黃蓓*

1(安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥，230601) 2(安徽省農(nóng)科院，安徽 合肥，230031)

藍莓又名篤斯、藍漿果，屬杜鵑花科，越橘屬植物，原產(chǎn)和主產(chǎn)于美國又被稱為美國藍莓。我國藍莓主要以北高叢、半高叢、矮叢以及兔眼藍莓為主，如布里吉塔、芭爾德溫等，種植面積約47萬畝，藍莓產(chǎn)量僅為3.133萬h2。藍莓果實中除了常規(guī)的酸和VC外，富含VE、VA、VB、SOD、蛋白質(zhì)、花青苷、食用纖維以及豐富的K、Fe、Zn、Ca等礦質(zhì)元素,且低糖、低脂肪，因此被國際糧農(nóng)組織列為人類5大健康食品之一，被譽為“漿果之王”[1-2]。

硒元素是在1918年由瑞典化學家JBERZELIUZ發(fā)現(xiàn)，并在1973年被世界衛(wèi)生組織定為生物生命活動必需的微量元素。研究顯示硒作為含硒的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性中心，調(diào)節(jié)著生物體抗氧化防御體系的主要組成部分[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，硒在植物體內(nèi)還有拮抗重金屬，調(diào)節(jié)包括VC、VE在內(nèi)的非酶氧化系統(tǒng)，平衡功能元素在體內(nèi)代謝的功能。農(nóng)業(yè)應用中多以亞硒酸鈉作為農(nóng)產(chǎn)品中外加源硒的硒源，但亞硒酸鈉存在使用安全性等問題，本實驗所用的是低毒有機硒營養(yǎng)液。張敏等[15]在含硒鹽培養(yǎng)基中加入ZM菌發(fā)酵，制得生物硒，且已證明作為主藥治療癌癥時無不良反應。劉軍等[16]研究說明生物硒比無機硒更能安全有效地促進韭菜葉片對N、P、K、Mg、Ca、Zn等營養(yǎng)元素的吸收。與亞硒酸鈉相比，EM(effective micro-organism)菌發(fā)酵制得的生物硒明顯提高大米中硒的含量，而且葉面噴施更安全有效[17]。生物硒制備方法是我國自主研發(fā)的微生物生產(chǎn)菌硒的工藝。生物硒肥是一類成本低、效果高、毒性小的新型富硒肥料[18]。給藍莓施亞硒酸鈉后，漿果中總硒、有機硒、可溶性糖的含量及SOD活性明顯提高，促進礦質(zhì)元素吸收，而且葉面噴施的效果優(yōu)于土壤基施[19]。目前關于噴施生物硒肥后藍莓營養(yǎng)品質(zhì)的變化及對小鼠抗氧化功能影響的研究未見報道。

本實驗利用亞硒酸鈉與菌種發(fā)酵所制備的有機硒營養(yǎng)液葉面噴施藍莓植株，檢測其營養(yǎng)指標，通過體外培養(yǎng)細胞自由基清除實驗及小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性實驗，評估硒對藍莓營養(yǎng)品質(zhì)改善以及施有機硒藍莓對抗氧化能力的影響效果，為優(yōu)質(zhì)抗氧化活性的藍莓產(chǎn)品的開發(fā)應用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料、動物與試劑

藍莓(布里吉塔)植株，由安徽蕪湖宏源農(nóng)業(yè)有限公司提供。

亞硒酸鈉水溶液及發(fā)酵菌種(酵母菌和枯草桿菌等多種益生菌)，由安徽省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所提供。

SPF級昆明小鼠40只，體重(20±2)g，雄性，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。

HepG2細胞，購自上海中科院細胞庫。

GIBCO血清，Thermo Fisher；DMEM培養(yǎng)基，HyClone公司產(chǎn)品；活性氧檢測試劑盒，碧云天生物技術公司；H2O2(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH-Px試劑盒、VC試劑盒、VE試劑盒，南京建成生物研究所；HNO3(分析純)，上海振興化工二廠；HClO4(分析純)，上海金鹿化工有限公司；NaBH4(分析純)，湖北賽創(chuàng)科技有限責任公司；HCl、乙酸鈉、KCl及甲醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2　儀器與設備

AFS-3100型雙道原子熒光光度計，北京海光儀器公司；SameCOM Liss XA量子共振檢測儀，同康科技有限公司；UItrospec 3100 pro紫外可見分光光度計，英國柏楉有限公司；Eppendorf centrifuge 5417R離心機，德國Eppendorf公司；Alpha 1-2 LD plus凍干機，德國Chriet公司；激光共聚焦顯微鏡FV1000-IX81，日本OLYMPUS公司；3308型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Forma公司。

1.3　實驗方法

1.3.1有機硒營養(yǎng)液制備及施肥方法

利用安徽省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所提供的亞硒酸鈉水溶液和菌種以及基料，在實驗室中把菌種和液體基料混合攪拌均勻后好氧保存1 d，加入無機態(tài)亞硒酸鈉溶液，每次加入的亞硒酸鈉總量2.0 g/100 mL混合液，共加入2次，間隔7 d。期間開口攪拌或搖晃，作用14 d后，紅色溶液增稠、穩(wěn)定即形成試驗用有機硒營養(yǎng)液產(chǎn)品。

在試驗區(qū)內(nèi)，選擇長勢大小一致的5年生植株，分為對照組、無機硒組和有機硒組，每組選20株藍莓，對照為清水，無機硒組為亞硒酸鈉水溶液，有機硒組為有機硒營養(yǎng)液，無機硒組和有機硒組總Se含量一致，分別在座果后期、膨大前期、膨大后期葉面噴施，施用量為1次或2次，間隔10到15 d，總硒劑量理論值以2 g/畝(220棵)計算, 噴灑質(zhì)量濃度為50 mg/L，座果25 d后收集果實，稱取重量，計算單顆平均重量，檢測硒的含量及有機硒和總硒的比值。

1.3.2硒含量的測定

將采集的新鮮的清水藍莓(watered blueberry ,WB)、無機硒藍莓(selenium blueberry ,SB)及有機硒藍莓(organic selenium blueberry ,OSB)制成勻漿，冷凍干燥，分別稱取1.0 g干粉于50 mL三角瓶中，加入10 mLV(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1混合酸液，放置12 h，置于電熱板上低溫加熱蒸發(fā)至有機物分解或色澤加深，補加1～3 mL消化液繼續(xù)消化，如此反復至消化液澄清，有HClO4白煙冒出，繼續(xù)加熱至溶液1～3 mL，用60%濃HCl定容在25 mL容量瓶中，然后加0.5% NaBH4至反應終點，用雙道原子熒光光度計測量總硒含量。

將采集的各組新鮮的藍莓制成勻漿，冷凍干燥，分別稱取1.0 g干粉，加10～20 mL的蒸餾水，置于加熱板上加熱沸騰20～30 min，冷卻,4 000 r/min離心10 min，保存上清液，殘渣再重復1次操作，合并上清液，加入10 mLV(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1混合酸液，放置12 h，置于電熱板上低溫加熱至有機物分解或色澤加深，補加1～2 mL消化液繼續(xù)消化，如此反復至消化液澄清，有HClO4白煙冒出，繼續(xù)加熱至溶液1～2 mL，用60%濃HCl定容在25 mL容量瓶中，然后加0.5% NaBH4至反應終點，用雙道原子熒光光度計測量無機硒含量，然后總硒含量減去無機硒含量即是有機硒的含量。

1.3.3藍莓中營養(yǎng)指標的檢測

將各組藍莓新鮮果實打成勻漿，分別用pH計和手持數(shù)顯糖度計測定pH值和可溶性固形物含量；采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量；參照吳春霞等[20]方法對總黃酮含量進行測定；采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量[21]；采用蒽酮法測定可溶性糖含量[22]。

1.3.4總SOD活性及VC、VE與花青素含量的檢測

準確稱取新鮮藍莓2 g，加入0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液8 mL，冰水浴條件下，機械勻漿，勻漿液在4 ℃條件下，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液，依照試劑盒要求測定總SOD的含量。

稱取新鮮的藍莓50 mg，加入450 μL的PBS，冰水浴研磨破碎，4 ℃條件下，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液，依照試劑盒要求測定VC的含量。

稱取新鮮的藍莓1 g，加入試劑盒中的試劑四(勻漿介質(zhì))9 mL，冰水浴研磨勻漿，4 ℃條件下，以2 500 r/min離心10 min，收集上清液，依照試劑盒要求測定VE的含量。

花青素提取液的制備：參照周方等[23]的方法并改進，分別稱取各組新鮮的藍莓各4 g，分別放入50 mL的離心管中，再各加入40 mL的鹽酸-甲醇混合液(含0.1%的HCl)，在80 ℃下振蕩提取30 min，收集提取液，在3 000 r/min下離心30 min后收集上清液待測。

花青素含量測定[24]：吸取樣液1 mL,加入pH 4.5的乙酸鈉緩沖液4 mL，搖勻，測定在波長520 nm和700 nm處的吸光度值；同上，吸取上述樣液1 mL，加入pH 1.0的KCl緩沖液4 mL，搖勻，測定波長510 nm和700 nm處的吸光度值。

1.3.5量子共振檢測樣品的量價值

將采集的各組新鮮的藍莓制成勻漿，冷凍干燥成干粉，分別稱取1.0 g左右的樣品干粉直接放在檢測盤上，利用量子共振檢測儀檢測各組藍莓的磷、鉀、氮、鈣、維生素等營養(yǎng)價值指標的量價值，以及分析其免疫功能等生理功能指標的量價值。

1.3.6細胞內(nèi)活性氧檢測

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，用胰蛋白酶消化并用含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)制成 5×104個/mL，以每皿 1 mL接種至共聚焦小皿中。細胞生長到80%時，棄去舊的培養(yǎng)液；分別加入含SB(27.04 mg/mL)、OSB(27.04 mg/mL)及WB(27.04 mg/mL)的細胞培養(yǎng)基1 mL，孵育3 h后，加入10 mmol/L H2O2溶液25 μL(終濃度為2 mmol/L),陰性對照組(negative control ,NC)加入等量的PBS，孵育1 h，取出舊的細胞液，用 PBS 洗滌細胞2次，加入10 μmol/L的DCFH-DA溶液 1 mL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后吸棄，并用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞，再加入1 mL的無血清細胞培養(yǎng)液，將小皿置于共聚焦顯微鏡上，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長 525 nm記錄胞內(nèi)熒光強度，使用ImageJ軟件分析胞內(nèi)熒光強度。

1.3.7小鼠模型的建立及檢測

將小鼠隨機分成4組：陰性對照組(negative control ,NC)，WB組，SB組，OSB組,每組10只。NC組每日灌胃蒸餾水；WB組每日灌胃施清水藍莓，灌胃劑量是10 g/kg；SB組和OSB組每日分別灌胃施無機硒藍莓勻漿、施有機硒藍莓勻漿，灌胃劑量是10 g/kg，連續(xù)30 d。實驗過程中，小鼠采取自由進食、飲水，隔日換水、換墊料。

血清中GSH-Px、SOD的檢測：小鼠斷尾取血，血樣4 ℃靜置2 h后，3 000 r/min，4 ℃離心15 min，獲得上層血清，-20 ℃保存待測。

肝臟中MDA的檢測：取0.5 g的肝臟組織，取5 mL的生理鹽水放入燒杯中研磨，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清液用MDA的檢測試劑盒進行檢測。

1.3.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2　結(jié)果與分析

2.1　有機硒營養(yǎng)液對藍莓中營養(yǎng)價值的影響

試驗中沒有測定噴施清水和硒以外的同區(qū)域藍莓，不能得知施用硒與否對藍莓產(chǎn)量的影響，但從表1中藍莓的單顆平均重量來估算，施用硒后，藍莓產(chǎn)量均有一定幅度的增加。噴施亞硒酸鈉水溶液的藍莓每顆平均重量增加3.77%(p>0.05)，施用有機硒營養(yǎng)液的藍莓每顆平均質(zhì)量增加6.25%(p>0.05)，即有機硒營養(yǎng)液處理組的增產(chǎn)幅度比亞硒酸鈉水溶液處理組的增產(chǎn)幅度高，且WB中有機硒與總硒的比值為69.70%，SB中有機硒與總硒的比值為72.83%, OSB中有機硒與總硒的比值為76.36%, SB和OSB中硒含量分別是WB的1.39倍與1.67倍，說明有機硒營養(yǎng)液比亞硒酸鈉溶液更容易被藍莓葉片吸收利用和轉(zhuǎn)運。

由表1可知，施用硒與否，對藍莓的pH值影響不明顯(p>0.05)，與WB相比，SB和OSB中蛋白質(zhì)含量分別提高了14.55%(p<0.01)和24.84%(p<0.01)，可溶性糖含量分別比WB提高了15.15%(p<0.01)和25.89%(p<0.01)，可溶性固形物含量分別提高了12.06%(p<0.05)和22.10%(p<0.01)。

表1　各組藍莓果實重量和營養(yǎng)物質(zhì)比較Table 1　Comparison of weight and nutritional compounds in fruits of different blueberry groups

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，同列不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)；WB，清水藍莓；SB，無機硒藍莓；OSB，有機硒藍莓。表2同。

為探討藍莓噴施富硒營養(yǎng)液后對其抗氧化性的影響，本研究分析比較了各組藍莓鮮果中的總酚、總黃酮、VC、VE和花青素的含量及總SOD的活性。結(jié)果顯示：藍莓施肥后不但提高了硒的含量，也影響著與抗氧化活性有關的成分如總酚、總黃酮、VC、VE、花青素和總SOD等，與WB相比，SB和OSB中VC含量分別提高了17.77%(p<0.01)和30.08%(p<0.01)，VE含量分別比WB提高了18.74%(p>0.05)和31.71%(p>0.05)，花青素含量分別提高了10.30%(p>0.05)和20.00%(p>0.05)，總SOD活性分別提高了3.37%(p>0.05)和10.62%(p<0.01)，總酚含量分別提高了13.62%(p<0.01)和21.42%(p<0.01)，總黃酮含量分別提高了11.71%(p<0.01)和22.42%(p<0.01)，說明藍莓富硒后能夠顯著提高藍莓果中抗氧化成分的含量，且有機硒營養(yǎng)液比亞硒酸鈉水溶液作用更明顯，如表2所示。

表2　各組藍莓中抗氧化成分比較Table 2　Comparison of antioxidants of different blueberry groups

2.2　有機硒對藍莓主要功能元素的影響

與此同時，試驗用量子共振技術檢測了各組藍莓的主要功能元素的相對含量。量子共振QRS值越高，說明其含量或功能性越好。與WB進行比較，SB和OSB的磷、氮、鈣、鋅、硒的量價值都高于WB(表3)，OSB的氮、鈣、鋅、硒的量價值又高于SB；SB和OSB中維生素的量價值也都高于WB，且OSB高于SB；在功能性指標中，OSB的免疫功能量價值達到+7，而WB和SB分別只有+4和+5。以上結(jié)果表明，OSB的營養(yǎng)價值要高于WB和SB，免疫力更強，為增強其抗氧化能力奠定了良好的基礎。量子共振技術檢測得到的數(shù)據(jù)是相對值，只能做定性判斷的依據(jù)。

2.3　有機硒藍莓對細胞內(nèi)活性氧自由基的清除效果

表3　各組藍莓QRS值比較Table 3　Comparison of QRS value between blueberry andfertilizing selenium blueberry

活性氧自由基熒光探針DCFH-DA在細胞內(nèi)本身無熒光，但它可被胞內(nèi)的H2O2、HO及過氧化硝基氧化形成DCF，DCF激發(fā)后可發(fā)出綠色熒光，反映了胞內(nèi)活性氧自由基水平變化。本實驗利用H2O2誘導肝癌細胞HepG2產(chǎn)生較高濃度的自由基，然后分別添加WB、SB、OSB，比較分析其對自由基的清除效果。

圖 1(A～E)是各實驗組細胞經(jīng) DCFH-DA 染色后，共聚焦顯微鏡拍攝的細胞圖像。照片的亮度差異反映了細胞經(jīng)處理后產(chǎn)生的 DCF 熒光強度變化。圖1-F為細胞內(nèi)DCF熒光強度的定量統(tǒng)計分析結(jié)果。結(jié)果顯示：H2O2作用后胞內(nèi) ROS是對照組的180.41%(p<0.01)。WB、SB、OSB作用后胞內(nèi)ROS分別是正常對照組的161.74% (p<0.01)、144.43% 和130.82% 。相對于模型組(MG)，WB、SB、OSB作用后自由基清除率分別是10.34%(p>0.05)、19.94%(p<0.05)和27.49%(p<0.01)。由上可知，與SB處理組相比，有機硒藍莓對過氧化氫誘發(fā)的活性氧自由基抑制效果更顯著。

A-陰性對照組；B-模型組，暴露在過氧化氫下1 h；C-暴露在過氧化氫下1 h前，先用SB預處理3 h；D-暴露在過氧化氯下1 h前，先用WB預處理3 h；E-暴露在過氧化氯下1 h前，先用OSB預處理3 h；F-從A到E的熒光檢測DCF的水平圖1　有機硒藍莓對HepG2細胞內(nèi)活性氧自由基含量的影響Fig.1　Effects of fertilizing selenium blueberry on intracellular ROS levels in HepG2 cells注：+為顯著性小于0.01對比對照組(NC);*和**分別為顯著性小于0.05和0.01對比模型組(MG);比例尺：80 μm。

2.4　有機硒藍莓對小鼠抗氧化能力的影響

動物體內(nèi)抗氧化酶GSH-Px、SOD的活性水平及MDA的含量水平能夠反應機體的抗氧化能力。本實驗分別用WB、SB及OSB灌胃1個月后檢測小鼠體內(nèi)肝臟中MDA含量及血清中的GSH-Px、SOD的抗氧化酶活性。

由圖2-A可知，與NC組相比，OSB組、SB組小鼠肝臟組織中MDA 含量分別降低了51.53%(p<0.01)和29.81% (p<0.01)，而WB組只降低了15.02%(p<0.05)。由圖2-B、2-C可知，相對于NC組，WB組小鼠血清中GSH-Px和 SOD活性分別增高了12.48%和10.14%，無顯著性差異(p>0.05)；OSB組小鼠血清中GSH-Px和SOD活性顯著增高了55.94%(p<0.01)和45.93%(p<0.01)；SB組小鼠血清中GSH-Px和SOD活性明顯高于NC組(p<0.05),提高了38.02%和29.62%。

圖2　有機硒藍莓對小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性的影響Fig.2　Effect of organic selenium blueberry on the antioxidant enzyme activity in mice注：*和**分別為顯著性小于0.05和0.01對比對照組(NC)。

3　結(jié)論

研究顯示，硒被吸收后形成的硒蛋白可以提高植物的合成代謝效率，使VC、VE等還原型物質(zhì)合成量增加，即增強植物的抗氧化系統(tǒng)能力[25-26]。常溫下無機硒處理濃度為18.0～24.0 mg/L時可以提高SOD的活性[27]，進而影響作物的產(chǎn)量[28]。楊燕君[29]、寧嬋娟[30]等研究結(jié)果證明，給甜柿和紅富士蘋果噴施硒肥，可以增加水果中VC、可溶性糖和可溶性固形物的含量，提高水果的品質(zhì)。本實驗利用有機硒營養(yǎng)液噴施藍莓植株，檢測了施硒藍莓中蛋白質(zhì)、可溶性糖、可溶性固形物、總酚、總黃酮、微量元素Se、VC、VE和花青素的含量及總SOD的活性，以及氮、磷、鉀、鈣、鋅、維生素、免疫功能等指標的量價值，與噴清水組藍莓(WB)比較發(fā)現(xiàn)，富集硒的同時，藍莓中氮、磷、鈣、鋅的含量也發(fā)生了變化，施硒藍莓組中蛋白質(zhì)、可溶性糖、可溶性固形物、總酚、總黃酮、VC的含量及SOD的活性顯著大于WB，VE和花青素的含量也有所提高，且藍莓產(chǎn)量均有一定幅度的增加；而噴施有機硒營養(yǎng)液的藍莓無論產(chǎn)量還是營養(yǎng)價值以及功能元素和免疫能力的量價值都高于噴施亞硒酸鈉水溶液的藍莓。

藍莓富含多糖、黃銅、總酚、花色苷和維生素等抗氧化物質(zhì)，具備較強的抗氧化能力。陳健[31]、林清華[32]等研究發(fā)現(xiàn)，藍莓花青素通過降低血漿中ALT、MDA含量提高SOD、GSH-Px含量，可以對CCl4所致的小鼠肝損傷起到保護的作用。BARROS等[33]研究發(fā)現(xiàn)，藍莓中的多酚物質(zhì)具有抗氧化作用，且對DNA的損傷具有保護作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，相比清水藍莓和無機硒藍莓，有機硒藍莓能顯著降低小鼠肝組織中MDA的含量，提高血清中SOD和GSH-Px活性，更能有效的清除肝腫瘤細胞胞內(nèi)的氧自由基。以上實驗證實，有機硒具有較高的生物活性及吸收利用率，噴施有機硒營養(yǎng)液的藍莓其抗氧化性及功能元素量價值均高于噴施亞硒酸鈉水溶液的藍莓。

總之，硒的加入優(yōu)化了藍莓的營養(yǎng)譜，提高了藍莓抗氧化能力，有機硒藍莓是具有很大開發(fā)前景的一種天然高效抗氧化物。

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