高慧娟，馮九海，韓玉琦，劉軍杰，馬紅利，魏生龍*

1(甘肅省應(yīng)用真菌工程實(shí)驗(yàn)室，河西學(xué)院，甘肅 張掖，734000)2(河西學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖，734000)3(甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖，734000)

荷葉離褶傘(Lyophyllumdecastes(Fr.) Singer)是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值都很高的菌類[1-3]。且荷葉離褶傘菌絲體具有一定的富硒能力，在富硒的發(fā)酵過(guò)程中，硒的加入可有效提高菌絲體的干重[4]。

硒元素是生命活動(dòng)的必需元素，開發(fā)高效的富硒食品具有重要的意義[5-6]。多糖和硒結(jié)合成為硒多糖，是一種多糖有機(jī)硒化合物，其生物藥理活性普遍高于多糖和硒，更容易被機(jī)體吸收和利用[7]。硒多糖具有多種生理功能，可抗衰老、防治癌癥，治療多種免疫缺損疾病，誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的生物合成等多方面的生物活性[8-9]。天然硒多糖分布于許多動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，尤其是存在于植物體內(nèi)已經(jīng)得到證實(shí)[10]。然而，對(duì)硒多糖的全部功能和生化特性尚未完全清楚，在硒多糖的分子生物學(xué)研究、構(gòu)效關(guān)系以及作用機(jī)制等方面的直接證據(jù)和實(shí)驗(yàn)更是不足[11]。

本研究以20 L生物罐發(fā)酵富硒的荷葉離褶傘菌絲體為原料，通過(guò)4個(gè)單因素試驗(yàn)，探討提取時(shí)間、溫度、料液比和提取次數(shù)對(duì)荷葉離褶傘菌絲體多糖提取的影響，初步優(yōu)化其提取工藝；再通過(guò)Box-Behnken中心組合的響應(yīng)面試驗(yàn)，借助Design Expert 8軟件對(duì)多糖提取率進(jìn)行方差分析，得到硒多糖的最佳提取工藝條件，將純化后的硒多糖進(jìn)行紅外光譜比較分析，確定其組成結(jié)構(gòu)，為荷葉離褶傘菌絲體中硒多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

荷葉離褶傘，由甘肅省應(yīng)用真菌工程實(shí)驗(yàn)室提供；硒粉(化學(xué)純CP)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮(分析純)，上海中泰化學(xué)試劑有限公司；3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(化學(xué)純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇，氯仿，正丁醇，葡萄糖，濃H2SO4，濃HCl，濃HNO3，甲苯，NaOH，EDTA-Na2試劑均為分析純，水均為蒸餾水。

1.2　儀器與設(shè)備

V-1200型可見光分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；TDL-50大容量低速離心機(jī)(金壇市億能實(shí)驗(yàn)儀器場(chǎng))；LGJ-18冷凍干燥機(jī)(北京松源華科技發(fā)展有限公司)； RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；B260恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；DHG-9423A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.120 L生物罐發(fā)酵制備荷葉離褶傘菌絲體

富硒荷葉離褶傘菌絲體的制備：稱取黃豆100 g，浸泡12 h后打漿，煮沸5 min，冷卻至40 ℃加入5%蛋白酶，恒溫水浴8 h后用300目篩過(guò)濾，濾液備用；稱取玉米面600 g，按1∶10(g∶mL)加入65 ℃熱水，后加入5%的淀粉酶，恒溫水浴至水解液遇碘液無(wú)色為止，用300目篩過(guò)濾，濾液備用。

把黃豆酶解液和玉米淀粉酶解液的濾液混合，加入葡萄糖200 g，定容至20 L發(fā)酵罐中，121 ℃滅菌40 min，快速冷卻至22 ℃，接入10%的荷葉離褶傘三角瓶種子培養(yǎng)液，通入無(wú)菌空氣，使罐內(nèi)壓強(qiáng)為0.02 MPa的條件下培養(yǎng)，在發(fā)酵的第3天加入滅菌的Na2SeO3溶液，使其在發(fā)酵罐中濃度為4 μg/mL，發(fā)酵的第8天終止發(fā)酵，過(guò)濾，得到的菌絲體用清水清洗3遍，在冷凍干燥機(jī)中凍干，即為富硒的荷葉離褶傘菌絲體。

未富硒荷葉離褶傘菌絲體制備：在發(fā)酵過(guò)程中不加入滅菌的Na2SeO3溶液，其他過(guò)程同富硒菌絲體的制備。

1.3.2多糖的提取方法

多糖提取工藝流程： 20 L生物罐發(fā)酵的富硒菌絲體→干燥→打粉→超聲提取→離心→取上清液→濃縮→乙醇沉淀多糖→脫脂→Sevage試劑除蛋白→定容→測(cè)定含量多糖提取方法：將20 L生物罐發(fā)酵的富硒荷葉離褶傘菌絲體，放入真空干燥箱中進(jìn)行干燥，磨粉過(guò)100目篩制成標(biāo)準(zhǔn)粉[12]。精密稱取該樣品0.500 0 g，進(jìn)行超聲提取，提取后在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，合并上清液并減壓濃縮(≤50 mL)，加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，4 ℃冰箱中靜置12 h[13]，得多糖沉淀，沉淀經(jīng)乙醇反復(fù)洗滌后，用Sevage試劑除去蛋白質(zhì)，最后將上清液定容至50 mL備用。

1.3.3Sevage試劑除去蛋白質(zhì)

量取濃縮液的體積為V(mL)，向其加入1/5V的三氯甲烷和1/20V的正丁醇，振蕩20 min，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，合并上清液并測(cè)其體積，繼續(xù)加相應(yīng)體積的三氯甲烷和正丁醇，并重復(fù)上述操作，直至氯仿層與正丁醇層之間無(wú)白色沉淀[14]。

1.3.4多糖含量的測(cè)定

將葡萄糖放置于50～80 ℃的烘箱中烘8～10 h，取出后精確稱取0.010 0 g，加蒸餾水定容至100 mL，配制為0.1 mg/mL備用。

取7支15 mL洗凈并干燥的具塞試管，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加蒸餾水至2.0 mL，再精確加入硫酸蒽酮溶液(蒽酮0.1 g，80%硫酸溶液100 mL，溶解搖勻)6.0 mL后搖勻，沸水浴15 min，取出后放入冰浴冷卻15 min，以相應(yīng)試劑或蒸餾水為空白，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

取15 mL洗凈并干燥的具塞試管，精密量取樣品溶液2.0 mL加入，再精密加入硫酸蒽酮溶液6.0 mL后搖勻，沸水浴15 min，取出后放入冰浴冷卻15 min，以相應(yīng)試劑或蒸餾水為空白，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入線性回歸方程求出供試樣品溶液中多糖含量，再計(jì)算菌絲體樣品的多糖提取率。

(1)

式中：Y為供試樣品溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得多糖的質(zhì)量(mg)；N為稀釋倍數(shù)；V為定容體積(50 mL)；m為試驗(yàn)樣品質(zhì)量(g)；VS為樣品測(cè)定液的體積(2 mL)。

1.3.5硒含量的測(cè)定

精確稱取0.100 0 g硒標(biāo)準(zhǔn)品溶解于2 mL濃HNO3中，低溫下(≤100 ℃)加熱溶解至蒸干，用1∶1(體積比)HCl溶解，定容至1 L，使用時(shí)稀釋至1.0 μg/mL。

準(zhǔn)確吸取上述硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置于125 mL分液漏斗中，加水定容至25 mL，分別加入5% EDTA-Na2溶液1 mL，用1∶1 HCl調(diào)節(jié)溶液至pH 2～3，再加入0.5% 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺溶液4 mL(現(xiàn)用現(xiàn)配)，搖勻，置暗處20 min后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加入10 mL甲苯振蕩2 min，靜置分層，棄水層，甲苯層用比色皿于420 nm處測(cè)其吸光值(以相應(yīng)試劑為空白)，以硒含量為橫坐標(biāo)(μg)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

稱取0.050 0 g富硒菌絲體樣品溶于2 mL濃HNO3，在電熱爐中加熱(控制溫度160～180 ℃)消化，至樣品完全溶解，溶液呈澄清，停止加熱并冷卻至70 ℃，加入1∶1 HCl，定容4 mL后備用。

準(zhǔn)確移取上述備用溶液0.5 mL，定容至25 mL后，取出4mL定容至25 mL，并轉(zhuǎn)入125 mL分液漏斗中，加水定容至25 mL，分別加入5% EDTA-Na2溶液1 mL，用1∶1 HCl調(diào)節(jié)溶液至pH 2～3，再加入0.5% 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺溶液4 mL，搖勻，置暗處20 min后，用10%NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加入10 mL甲苯振蕩2 min，靜置分層，棄水層，甲苯層用比色皿于420 nm處測(cè)其吸光值，以相應(yīng)試劑為空白。根據(jù)樣品溶液測(cè)得的吸光值，結(jié)合硒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的硒含量。

1.3.6單因素試驗(yàn)方法

1.3.6.1提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

精密稱取富硒菌絲體樣品0.500 0 g，在提取時(shí)間分別為15、30、45、60、75 min，提取溫度為60 ℃，料液比1∶60的條件下超聲提取1次。提取后在3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心15 min，將清液減壓濃縮后(≤50 mL)，加入3倍體積95%乙醇，4 ℃冰箱中靜置12 h，得多糖沉淀，沉淀經(jīng)乙醇反復(fù)洗滌，用Sevage試劑除去蛋白質(zhì)，最后將上清液定容至50 mL。采用蒽酮比色法測(cè)定多糖的含量，并計(jì)算多糖提取率，研究提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響。

1.3.6.2提取溫度對(duì)多糖提取的影響

精密稱取樣品(標(biāo)準(zhǔn)粉)0.500 0 g，在提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，提取時(shí)間為45 min，料液比1∶60條件下超聲提取1次。提取后同1.3.3測(cè)定多糖的含量，并計(jì)算多糖提取率，以此來(lái)研究提取溫度對(duì)多糖提取的影響。

1.3.6.3不同料液比對(duì)多糖提取的影響

精密稱取樣品(標(biāo)準(zhǔn)粉)0.500 0 g，在料液比分別為1∶40、1∶80、1∶120、1∶160、1∶200時(shí)向每個(gè)三角瓶中加入蒸餾水，提取時(shí)間為45 min，溫度80 ℃的恒溫條件下超聲提取1次。提取后同1.3.3測(cè)定多糖的含量，并計(jì)算多糖提取率，以此來(lái)研究料液比對(duì)多糖提取的影響。

1.3.6.4提取次數(shù)對(duì)多糖提取的影響

精密稱取樣品(標(biāo)準(zhǔn)粉)0.500 0 g，在提取次數(shù)分別為1、2、3、4次，提取時(shí)間為45 min，料液比為1∶120，80 ℃的恒溫條件下提取，提取后同1.3.3測(cè)定多糖的含量，并計(jì)算多糖提取率。來(lái)研究提取次數(shù)對(duì)多糖提取的影響。

1.3.7響應(yīng)面試驗(yàn)方法

在4個(gè)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選定影響因素并確定因素水平，用Box-Behnken中心組合原理[17]。設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)表格。以多糖提取率為參考指標(biāo)，來(lái)確定多糖提取的最佳提取工藝條件。選取對(duì)多糖提取影響的4個(gè)因素，即：提取時(shí)間、提取溫度、料液比數(shù)和提取次數(shù)，分別以A、B、C和D表示。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

1.3.8未富硒荷葉離褶傘菌絲體中多糖的提取

在富硒荷葉離褶傘菌絲體中，多糖提取的優(yōu)化條件下，對(duì)未富硒荷葉離褶傘菌絲體中多糖進(jìn)行提取。

表1　Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and levels in Box-Behnken design

1.3.9硒多糖的紅外色譜檢測(cè)

分別取1 mg干燥純化的富硒菌絲體和未富硒菌絲體中多糖樣品，與100～200 mg干燥的KBr粉末在研缽中輕輕研磨均勻，在紅外燈下操作，經(jīng)壓片機(jī)壓成薄片，于4 000～400 cm-1進(jìn)行紅外光譜測(cè)定[18]。

2　結(jié)果與分析

2.1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光值(OD值)為縱坐標(biāo)，多糖質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=4.69X-0.008 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，符合精度要求，如圖1所示。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of glucose

2.2　硒標(biāo)準(zhǔn)曲線及硒含量

硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：以吸光值(OD值)為縱坐標(biāo)，硒含量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

圖2　硒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of selenium

得回歸方程Y=0.015 1X-0.001 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 4，具有較好的相關(guān)性。

根據(jù)硒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得出荷葉離褶傘菌絲體中富硒量達(dá)到114.2 μg/g，說(shuō)明荷葉離褶傘菌絲體中是富含硒的。由于硒含量測(cè)定方法操作復(fù)雜，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，綜合考慮后，以多糖提取率的變化來(lái)說(shuō)明荷葉離褶傘菌絲體中硒多糖提取的變化。

2.3　提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，硒多糖的提取率逐漸增加，45 min時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值10.97%，之后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率又有所減少(見圖3)。結(jié)果表明，多糖的提取過(guò)程與時(shí)間密切相關(guān)，超聲時(shí)間較短則產(chǎn)物溶解不充分，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又出現(xiàn)大分子多糖在超聲波的強(qiáng)剪切作用下降解的現(xiàn)象，而導(dǎo)致多糖損失[18]。從節(jié)約能源、減少生產(chǎn)周期考慮，提取時(shí)間在45 min左右為宜。

圖3　提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3　Effect of extraction rate time on the polysaccharide

2.4　提取溫度對(duì)多糖提取的影響

在50～80 ℃內(nèi)，隨著提取溫度的升高，多糖提取率逐漸增加，80 ℃后隨著提取溫度的升高，多糖的提取率反而下降(見圖4)。

圖4　提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.4　Effect of extraction rate temperature on thepolysaccharide

與單斌等[19]在響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取苦瓜多糖工藝的研究中基本一致，由此說(shuō)明不同植物多糖提取的最佳溫度不同，但其多糖的提取的變化趨勢(shì)相同。這是由于在升溫和超聲作用下，當(dāng)液體所受到的負(fù)壓足夠大時(shí)，媒質(zhì)分子間的平均距離超過(guò)極限距離后，就會(huì)破壞液體結(jié)構(gòu)的完整性，造成空穴。綜合考慮，提取溫度選擇80 ℃較適宜。

2.5　不同料液比對(duì)多糖提取的影響

由圖5可知，在料液比較低時(shí)，多糖的浸出量隨料液比的增大而顯著增加，并在料液比1∶120時(shí)多糖提取率達(dá)到33.94%，但增大到一定程度后，多糖提取率基本不再變化。考慮到后序操作工藝與成本問(wèn)題，選擇料液比1∶120為宜。

圖5　料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.5　Effects of extraction rate material to water on thepolysaccharide

2.6　提取次數(shù)對(duì)多糖提取的影響

隨著提取次數(shù)的增加，多糖提取率幾乎呈直線下降。提取1次時(shí)，大部分多糖已被提?。粚V渣再次提取時(shí)，有部分多糖被提取；提取第3、4次時(shí)，多糖提取率接近于零，結(jié)果見圖6。從節(jié)省能耗與縮短生產(chǎn)周期考慮，提取次數(shù)選擇2次為宜。

圖6　提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.6　Effect of extraction rate times on the polysaccharide

2.7　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.7.1模型的建立及顯著性檢驗(yàn)與分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析因素與設(shè)計(jì)見表2，表中的數(shù)據(jù)經(jīng) Design-Expert 8統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，所得的主要分析結(jié)果見表3。

表2　響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2　Box-Behnken experimental design andexperimental results for response surface analysis

用Design Expert 8程序軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素回歸擬合后，得到多糖提取率四因素間的元二次回歸方程：

Y=-334.643 64+1.422 04A+5.957 62B+1.251 32C+12.919 23D+8.486 14×10-3AB-1.945 63×10-4AC+0.033 333AD+1.500 53×10-3BC+0.062 313BD-0.021 828CD-0.026 48A2-0.040 372B2-5.154 48×10-3C2-3.551 01D2

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。式中Y為多糖提取率，A、B、C和D為上述4個(gè)變量的編碼值?；貧w項(xiàng)中p<0.000 1，說(shuō)明所選擇模型高度顯著；失擬項(xiàng)p=0.974 4>0.05，即失擬項(xiàng)差異不顯著，表明該二次回歸模型能夠較顯著擬合試驗(yàn)；回歸模型R2=0.945 6，說(shuō)明該模型能夠解釋94.56%的響應(yīng)值變化，只有5.44%的變異不能用該模型解釋。因此該模型是極其顯著而且可靠的，能夠?qū)Χ嗵翘崛∵M(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖7反映了各因素交互作用對(duì)荷葉離褶傘菌絲體中多糖提取率的影響，比較6組圖可知：料液比對(duì)多糖提取率的影響較大，曲線變化較陡；提取時(shí)間次之；提取溫度對(duì)多糖提取率的影響最小，曲面變化比較平緩。

2.7.2最佳提取工藝的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

借助Design Expert 8統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到最佳提取工藝條件：提取時(shí)間50.45 min、提取溫度83.3 ℃、料液比1∶127.47 (g∶mL)、提取次數(shù)2.39次，理論上多糖提取率為44.60%。為了實(shí)際操作方便，調(diào)整其最佳提取工藝條件為提取時(shí)間50 min、提取溫度83 ℃、料液比1∶130 (g∶mL)、提取次數(shù)2次。在此條件下，對(duì)荷葉離褶傘菌絲體中硒多糖進(jìn)行提取，通過(guò)3次平行試驗(yàn)，測(cè)得多糖提取率為44.62%，與預(yù)測(cè)的理論值相差甚少，再次驗(yàn)證了回歸模型的正確性。并用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法測(cè)定硒含量，由硒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得硒含量為31.9 μg/g。說(shuō)明該方程和實(shí)際的情況比較相符，實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分驗(yàn)證了模型的正確性，說(shuō)明荷葉離褶傘菌絲體中硒多糖的提取工藝優(yōu)化結(jié)果是有效的。

表3　響應(yīng)面分析試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3　Analysis of variance for the developed regression model

注：*差異顯著(p<0.05)；**差異極顯著(p<0.01)。

A-提取時(shí)間與提取溫度; B-提取時(shí)間與料液比C-提取時(shí)間與提取次數(shù);D-提取溫度與料液比;E-提取溫度與提取次數(shù);F-料液比與提取次數(shù)圖7　各因素交互作用對(duì)荷葉離褶傘菌絲體多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface plots showing the interactive effectsof various extractio conditions on extraction rate polysaccharideLyophyllum decastes mycelia

2.8　荷葉離褶傘菌絲體中硒多糖的結(jié)構(gòu)分析

圖8　未富硒荷葉離褶傘菌絲體中水溶性多糖的IR圖譜Fig.8　IR spectrum of water-soluble polysaccharidein common Lyophyllum decastes mycelia

圖9　富硒荷葉離褶傘菌絲體中水溶性多糖的IR圖譜Fig.9　IR spectrum of water-soluble polysaccharidein Se-enriched Lyophyllum decastes mycelia

3　討論

本試驗(yàn)以20 L生物培養(yǎng)罐發(fā)酵的荷葉離褶傘菌絲體為原料，通過(guò)4個(gè)單因素試驗(yàn)，探討提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)對(duì)多糖提取的影響，初步優(yōu)化提取工藝；再通過(guò)Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)了4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，借助Design Expert 8軟件處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行多元回歸分析，得到了4個(gè)單因素與多糖提取率的回歸模型，分析各因素交會(huì)作用對(duì)荷葉離褶傘菌絲體中多糖提取率的影響，最終得到模型最優(yōu)值時(shí)的最佳提取工藝條件：提取時(shí)間50.45 min、提取溫度83.3 ℃、料液比1∶127.47 (g∶mL)、提取次數(shù)2.39次，預(yù)測(cè)多糖提取率為44.60%。為了試驗(yàn)操作的可行性，調(diào)整提取時(shí)間為50 min、提取溫度83 ℃、料液比1∶130 (g∶mL)、提取次數(shù)2次，測(cè)得多糖提取率為44.62%，此時(shí)多糖中硒含量達(dá)到31.9 μg/g。本文通過(guò)響應(yīng)面分析法建立了各因素與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)模型，可以較直觀地看出不同因素之間的交互作用，有針對(duì)性地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，可減少試驗(yàn)次數(shù)，提高效率，在實(shí)際生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)富硒前后2種形態(tài)硒多糖的紅外光譜結(jié)構(gòu)分析可知，通過(guò)醇沉方法提取的可溶性多糖具有多糖的一般特征吸收峰, 且是β-糖苷鍵連接的吡喃多糖。富硒未改變水溶性硒多糖的主體結(jié)構(gòu)，但多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

近年來(lái)，人們通過(guò)人工方法獲取硒多糖，即在適宜培養(yǎng)條件下將無(wú)機(jī)硒添加到真菌、藻類等的培養(yǎng)基中，通過(guò)真菌、藻類等的生長(zhǎng)代謝，對(duì)硒進(jìn)行富集和生物轉(zhuǎn)化來(lái)獲得硒多糖。查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知，硒多糖的提取分離方法與一般多糖的提取分離方法相似。但對(duì)大多數(shù)天然硒多糖或生物富集硒多糖中硒以何種方式進(jìn)入、與何種單糖結(jié)合、結(jié)合的位點(diǎn)如何等問(wèn)題還未見報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。

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