熊妍妍，薛宇航，陳小娥*，馮淑瑩，方旭波，袁高峰，余輝

1(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山，316022)2(杭州萬(wàn)向職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州，310023)

殼聚糖酶(chitosanase，EC3.2.1.132.)是一種以?xún)?nèi)切方式催化水解部分乙酰化殼聚糖中β-1,4氨基葡萄糖苷鍵的酶，它能將殼聚糖(chitosan)降解為殼寡糖(chitooligosaccharides)。殼寡糖由于其生物相容性好，易于被人體吸收等優(yōu)勢(shì)，其商業(yè)產(chǎn)品已滲透諸多領(lǐng)域，主要涉及功能性食品、藥品、環(huán)保、化工等[1]。目前獲得殼寡糖的方法有物理法、化學(xué)法和生物酶解法三大類(lèi)。相比而言，物理法、化學(xué)法生產(chǎn)殼寡糖會(huì)受到分離成本高、污染嚴(yán)重等限制，而生物酶解法生產(chǎn)殼寡糖則有環(huán)境相容性好、成本低、重復(fù)性好、寡糖產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[2]，成為了目前殼寡糖生產(chǎn)的理想方法。研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖酶不僅可以降解殼聚糖，在農(nóng)業(yè)上也可作為生物防治劑，在生物技術(shù)中可用于原生質(zhì)體分離、細(xì)胞化學(xué)定位和生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白等[3]。因此，如何獲得優(yōu)良菌株成為了開(kāi)發(fā)殼聚糖酶微生物發(fā)酵法的重要任務(wù)[4]。

從自然界篩選出的野生菌株產(chǎn)酶能力一般不高，通過(guò)誘變選育是提高產(chǎn)酶水平的有效途徑之一[5]。冷源等離體子是一種新型的誘變方法，它在電離過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基使遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，如堿基缺失，染色體異位等[6-9]，誘變效率高。此外，冷源等離子體誘變還具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)約時(shí)間、無(wú)毒害性、無(wú)嚴(yán)苛條件等優(yōu)點(diǎn)，被食品加工、制藥等行業(yè)廣泛地應(yīng)用[10]。

目前關(guān)于產(chǎn)殼聚糖酶菌株的誘變選育研究大多采用紫外誘變[11]、化學(xué)誘變[12]，采用冷源等離子體誘變的報(bào)道較少。本研究以本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的菌種為原始菌株，對(duì)其進(jìn)行冷源等離子體誘變，探究誘變的最佳條件，并從中篩選出1株產(chǎn)殼聚糖酶活力最高的菌株，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為殼聚糖酶的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種

鹿皮曲霉(Aspergilluscervinus)ZJOU-AC1，浙江海洋大學(xué)食品與科學(xué)工程研究室篩選保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，121 ℃滅菌20 min。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，121 ℃滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：膠體殼聚糖 5 g/L，酵母膏 1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 5.5～6.0，121 ℃滅菌20min[13]。

復(fù)篩培養(yǎng)基：膠體殼聚糖 5 g/L，酵母膏 1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 5.5～6.0，121 ℃滅菌20 min[13]。

種子培養(yǎng)基：膠體殼聚糖 2 g/L，葡萄糖 10 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，自然pH，121 ℃滅菌20 min[14]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：膠體殼聚糖15 g/L，麩皮 20 g/L，(NH4)2SO44 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，Tween-80 0.6 g/L，121 ℃滅菌20 min[14]。

1.2　儀器與設(shè)備

Phenix BK130 /3低溫等離子體處理儀，美國(guó)鳳凰科技公司；UV-5900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JB-CJ-1FXS 型超凈工作臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；HYC-A全溫?fù)u床，上海璽袁科學(xué)儀器有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1冷源等離子體誘變

(1)誘變前預(yù)處理：用100 mL無(wú)菌水洗下斜面上的孢子，倒入盛有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，28 ℃振蕩30 min，得到孢子懸液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整孢子濃度為1×106～5×106個(gè)/mL，濃度用CFU法確認(rèn)[15]。用移液槍移取3 mL孢子懸液，均勻地涂布于無(wú)菌平皿中，準(zhǔn)備進(jìn)行低溫等離子體誘變。

(2)誘變處理：將裝有孢子懸液的平皿放在低溫等離子體處理儀的兩個(gè)電極之間，把電壓瞬間調(diào)到40 kV，處理的時(shí)間分別為0～270 s(處理時(shí)間每隔15 s遞增)[16]。

(3)誘變后培養(yǎng)：處理后取出平皿，傾斜，用移液槍移取平皿中的孢子懸液，反復(fù)輕柔地沖洗平皿上誘變后的孢子。用移液槍移取500 μL孢子懸液，均勻地涂布于初篩培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，用于單菌落的挑選和致死率的計(jì)算。

(4)培養(yǎng)后致死率和突變率的計(jì)算：誘變培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的單菌落數(shù)，計(jì)算致死率。

(1)

式中[17]：N為對(duì)照組單菌落數(shù),CFU/mL；N’為實(shí)驗(yàn)組單菌落數(shù),CFU/mL。

以原始菌株為對(duì)照，統(tǒng)計(jì)誘變菌株的透明圈大小。用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明圈直徑與菌株直徑，并計(jì)算HC值(透明圈直徑mm/菌株直徑mm)。以HC值為標(biāo)準(zhǔn)，將比值減小或增加10%以上的誘變菌株定義為突變菌株，按公式(1)計(jì)算：

(2)

1.3.2突變菌株的篩選

(1)初篩和復(fù)篩：在最佳誘變時(shí)間段內(nèi)，選擇生長(zhǎng)良好的正突變菌株，分別統(tǒng)計(jì)HC值并接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定殼聚糖酶活力，發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間100 h，發(fā)酵溫度28 ℃，初始pH值5.5，接種量3%，轉(zhuǎn)速150 r/min[18]。

(2)突變菌株的酶活力及生長(zhǎng)特性分析：將篩選出的突變菌株分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，150 r/min發(fā)酵培養(yǎng)7 d。每隔24 h取1 mL發(fā)酵液測(cè)定殼聚糖酶活力，取7 d內(nèi)的峰值；菌體的生物量測(cè)定采用通過(guò)比色法測(cè)定菌體核酸濃度，并用菌體干重和菌體核酸濃度的線(xiàn)性關(guān)系計(jì)算得到菌體濃度的方法[18]，每隔24 h測(cè)定1次。

(3)遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將復(fù)篩后酶活力較高的菌株連續(xù)傳代6代，每代都搖瓶發(fā)酵，分別測(cè)定各代菌株產(chǎn)的殼聚糖酶活力，驗(yàn)證菌株的遺傳穩(wěn)定性。

(4)突變菌株ZJOU-AC2在發(fā)酵培養(yǎng)基上的酶活曲線(xiàn)測(cè)定：將保存在斜面上的突變菌株ZJOU-AC2活化后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔6 h測(cè)1次殼聚糖酶活力。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)作生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.3突變菌株ZJOU-AC2發(fā)酵條件優(yōu)化

將突變菌株ZJOU-AC2接種到種子培養(yǎng)基中，于150 r/min，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)3 d。參照1.1.2中的發(fā)酵培養(yǎng)基，并設(shè)定初始培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度為28 ℃，初始pH值5.5，發(fā)酵時(shí)間為100 h，接種量為3%。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的主要影響因素(發(fā)酵溫度、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、接種量)進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，測(cè)定各發(fā)酵液的殼聚糖酶活力。在250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度設(shè)定為26，28，30，32，34 ℃；初始pH值設(shè)定為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0；發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為70，80，90，100，110 h；接種量分別設(shè)定為1%，2%，3%，4%，5%。在此基礎(chǔ)上，確定各水平的最佳范圍，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案。

1.3.4殼聚糖酶活力測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋成適當(dāng)倍數(shù)的殼聚糖酶液。取1 mL酶液，加入1 mL 1%的膠體殼聚糖，50 ℃下保溫15 min，立即加入2 mL DNS溶液，沸水浴10 min，顯色反應(yīng)后放入冷水中冷卻。再加入2 mL的蒸餾水，4 000 r/min離心10 min，取上清液在510 nm處測(cè)定吸光值。

1個(gè)酶活單位(U/mL)：1 mL酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmoL還原糖所需要的酶量。

1.3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，結(jié)果取平均值。用繪圖軟件Origin Pro 8.5繪制折線(xiàn)圖和柱狀圖，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　冷源等離子體誘變結(jié)果

2.1.1鹿皮曲霉誘變后致死率分析

冷源等離子體可以使氣體產(chǎn)生高度電離的混合物，混合物的多種成分能同時(shí)對(duì)菌體起作用。據(jù)報(bào)道，在冷源等離子體中能夠發(fā)生近500個(gè)反應(yīng)并生成超過(guò)75種活性物質(zhì)[10]。這些活性物質(zhì)能迅速改變微生物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與通透性，并引起基因的改變，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變[19]。因此，適宜的條件是控制微生物迅速突變的前提。

圖1　不同處理時(shí)間下鹿皮曲霉的致死率曲線(xiàn)Fig.1　Variaton of the lethal rate of the Aspergillus cervinusZJOU-AC1 with treatment time

根據(jù)誘變理論，80%～90%的致死率有利于正突變菌株的產(chǎn)生[20]。如圖1所示，0～150 s內(nèi)冷源等離子體對(duì)鹿皮曲霉的致死率存在一定的劑量關(guān)系，致死率曲線(xiàn)呈現(xiàn)經(jīng)典的馬鞍型[21]。在0～45 s之間，鹿皮曲霉的致死率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，而到45 s時(shí)致死率則開(kāi)始下降，到60 s時(shí)致死率下降到最低點(diǎn)，推斷是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)開(kāi)始工作[22]，修復(fù)了冷源等離子體誘變對(duì)細(xì)胞致死的損傷。隨著誘變時(shí)間的增加，由于細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)能力不足以修復(fù)誘變帶來(lái)的損傷，則致死率又開(kāi)始上升。圖1結(jié)果顯示，當(dāng)處理時(shí)間為90 s時(shí)，致死率為88.6%，處理105s以后致死率基本穩(wěn)定在90%以上，處理165 s致死率接近100%。

2.1.2鹿皮曲霉誘變后突變率分析

誘變后平板上共長(zhǎng)出183株誘變菌株，對(duì)誘變后的鹿皮曲霉進(jìn)行HC值測(cè)定。根據(jù)HC值測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明共有68株突變菌株，其中32株為正突變菌株即HC值增加10%以上。經(jīng)計(jì)算，鹿皮曲霉的突變率為37.16%，正突變率為17.49%。圖2為不同誘變時(shí)間下正突變率的結(jié)果。結(jié)果顯示，在90 s的時(shí)候，正突變率達(dá)到峰值4.37%，該結(jié)果與蔡聰[20,23]等人的研究相一致。為了獲得高產(chǎn)殼聚糖酶和生存能力較強(qiáng)的菌株，本實(shí)驗(yàn)選擇誘變時(shí)間為90 s的菌液平板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2　誘變后的正突變率結(jié)果Fig.2　The result of positive mutation rates after mutation

2.2　突變菌株的篩選結(jié)果

2.2.1初篩和復(fù)篩結(jié)果

當(dāng)誘變時(shí)間為90 s時(shí)，一共篩選出8株正突變菌株。結(jié)果由表1可知，突變菌株3#、4#、6#、7#的HC值較大且酶活力也較高。以出發(fā)菌株的酶活力作對(duì)照為100%，分別表現(xiàn)為菌株3#提高了52.1%，菌株4#提高了49.8%，菌株6#提高了40.4%，菌株7#提高了43.3%。因此，選取這4株突變菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1　冷源等離子體誘變初篩和復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果Table 1　The result of preliminary screening and secondary screening test after cold source plasma mutagenesising

2.2.2突變菌株的酶活力及生長(zhǎng)特性分析

由圖3和圖4可知，經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)后，4株突變菌株的酶活力均高于ZJOU-AC1，這與突變率分析時(shí)所測(cè)定的結(jié)果一致。其中菌株3#和菌株4#的酶活力提高較為明顯，菌株3#在培養(yǎng)4 d后的平均酶活力為12.56 U/mL，是ZJOU-AC1的1.52倍，菌株4#在培養(yǎng)4 d后的平均酶活力為12.37 U/mL，是ZJOU-AC1的1.5倍。從生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析，4株突變菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，且生長(zhǎng)速度均快于ZJOU-AC1。在第4天，生物量均達(dá)到最大值，此時(shí)生長(zhǎng)最快的菌株3#的生物量是ZJOU-AC1的1.11倍，明顯高于ZJOU-AC1。

圖3　突變菌株與ZJOU-AC1殼聚糖酶活力的比較Fig.3　Comparision of chitosanase activity betweenmutant strains and ZJOU-AC1

圖4　突變菌株與ZJOU-AC1生長(zhǎng)速度的比較Fig.4　Comparision of speed between mutant strainsand ZJOU-AC1

2.2.3突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

傳代結(jié)果如表2所示，菌株3#、4#、6#、7#均具有良好的遺傳穩(wěn)定性，相較而言，菌株3#、6#的穩(wěn)定性較差。其中，菌株4#在傳代過(guò)程中最高酶活達(dá)到12.45 U/mL，在ZJOU-AC1的基礎(chǔ)上提高了50.7%，菌株7#在傳代中的最高酶活為11.58 U/mL，酶活性明顯低于菌株4#。因此，選取菌株4#作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)菌株，并將其命名為AspergilluscervinusZJOU-AC2。

表2　突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Experimental results of genetic stability ofmutant strains

2.2.4突變菌株ZJOU-AC2在發(fā)酵培養(yǎng)基上的產(chǎn)酶曲線(xiàn)測(cè)定

由圖5可知，原始菌株ZJOU-AC1在0～96 h內(nèi)殼聚糖酶活力隨著時(shí)間的增加而增加，在96 h時(shí)殼聚糖酶活力達(dá)到最大值8.26 U/mL。突變菌株 ZJOU-AC2與ZJOU-AC1的產(chǎn)酶曲線(xiàn)趨勢(shì)相同，在90 h時(shí)殼聚糖酶活力達(dá)到最大值12.37 U/mL。從圖中的2條產(chǎn)酶曲線(xiàn)可以看出,ZJOU-AC2產(chǎn)殼聚糖酶活力峰值時(shí)間比ZJOU-AC1減少了6 h，且酶活力是ZJOU-AC1的1.49倍。說(shuō)明冷源等離子體誘變后可以減少鹿皮曲霉的發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵效率，具有很好的實(shí)際應(yīng)用性。

圖5　發(fā)酵時(shí)間對(duì)殼聚糖酶活力的影響Fig.5　Effect of fermentation time on chitoanase activity

2.3　突變菌株ZJOU-AC2發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

2.3.1發(fā)酵溫度對(duì)殼聚糖酶活力的影響

發(fā)酵溫度對(duì)突變菌株ZJOU-AC2的影響結(jié)果如圖6所示，隨著發(fā)酵溫度的提高，殼聚糖酶活力逐漸增大，在30 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值12.36 U/mL，隨后酶活力開(kāi)始下降。由于菌體對(duì)溫度較為敏感，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使其生命活動(dòng)能力和酶活力下降，不利于微生物的生長(zhǎng)代謝。

圖6　發(fā)酵溫度對(duì)殼聚糖酶活力的影響Fig.6　Effect of fermentation temperature on chitoanase activity

2.3.2初始pH值對(duì)殼聚糖酶活力的影響

由于發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中菌體的生命活動(dòng)，pH值一直在變化，不易控制，因此本實(shí)驗(yàn)只考慮初始pH值對(duì)殼聚糖酶活力的影響。結(jié)果由圖7可知，殼聚糖酶活力在初始pH值5.5～6.5范圍內(nèi)較為理想。當(dāng)發(fā)酵液的初始pH值為6.0時(shí)，酶活力最高，為12.43 U/mL。發(fā)酵過(guò)程中pH值的大小會(huì)影響菌體對(duì)殼聚糖的利用和殼聚糖酶的活力。

圖7　初始pH值對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響Fig.7　Effect of initial pH on chitoanase activity

2.3.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)殼聚糖酶活力的影響

圖8中，發(fā)酵時(shí)間在80～100 h時(shí)，酶活力較好；在90 h時(shí)，殼聚糖酶活力達(dá)到峰值為12.45 U/mL。推測(cè)是因?yàn)樵诎l(fā)酵初期，培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充裕，菌體大量繁殖，產(chǎn)生大量的殼聚糖酶，后期培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，同時(shí)菌體處于衰亡期，菌體數(shù)量開(kāi)始減少，故殼聚糖酶的生產(chǎn)也相應(yīng)減少。

圖8　發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響Fig.8　Effect of fermentation time on chitoanase activity

2.3.4接種量對(duì)殼聚糖酶活力的影響

圖9所示，接種量在2%～4%時(shí)，有利于殼聚糖酶的合成。接種量在1%～3%時(shí)，酶活力逐漸升高，在3%的接種量時(shí)酶活力最高，為11.41 U/mL。當(dāng)接種量大于3%，酶活力開(kāi)始下降。推測(cè)當(dāng)接種量在1%～3%時(shí)，隨著接種量的增加，菌體繁殖速度加快，產(chǎn)殼聚糖酶的能力也相應(yīng)增加，當(dāng)接種量大于3%后，菌體需要的能量大于培養(yǎng)基能提供的能量，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏導(dǎo)致殼聚糖酶活力下降。

圖9　接種量對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響Fig.9　Effect of inoculum on chitoanase activity

2.3.5正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以發(fā)酵溫度、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、接種量為因素，設(shè)計(jì)四因素撒水平正交試驗(yàn)。結(jié)果如表3所示，極差R值大小順序?yàn)椋篟B>RD>RA>RC，說(shuō)明初始pH值對(duì)殼聚糖酶活力影響最大，其次是接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間。K值分析結(jié)果顯示，4個(gè)因素的最優(yōu)組合為A2B2C1D2，即發(fā)酵溫度為30 ℃，初始pH值為6.0，發(fā)酵時(shí)間為80 h，接種量為3%。根據(jù)此組合進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(設(shè)置3個(gè)平行組)，得出最終酶活力為14.28±0.08 U/mL，高于正交試驗(yàn)中所有的組合結(jié)果，說(shuō)明該組合確實(shí)為最佳發(fā)酵條件。

表3　L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of L9(34) orthogonal test

3　結(jié)論

(1)冷源等離子體誘變篩選高產(chǎn)殼聚糖酶突變菌株的參數(shù)是：電壓為40 kV、輻照時(shí)間為90 s。篩選出一株酶活力提高50.7%的突變菌株，命名為鹿皮曲霉(Aspergilluscervinus)ZJOU-AC2。

(2)突變菌株鹿皮曲霉(Aspergilluscervinus)ZJOU-AC2正交試驗(yàn)結(jié)果表明：最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH 6.0，發(fā)酵時(shí)間為80 h，接種量為3%，比優(yōu)化前提高了15.07%。

(3)本研究使用冷源等離子體誘變鹿皮曲霉篩選突變菌株，具有方法簡(jiǎn)便、誘變效率高的特點(diǎn)，表明此誘變方法具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

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