侯靖，許文梅，崔恒林

(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇　鎮(zhèn)江，212013)

蛋白酶能催化蛋白質(zhì)肽鍵的水解，是用途最廣泛的酶制劑之一，廣泛應用于食品、洗滌、皮革等領(lǐng)域，在全球的銷售額占酶制劑總份額的46%左右[1]。目前對蛋白酶的研究主要集中在尋求具有特殊性質(zhì)的微生物酶來解決工業(yè)應用中酶蛋白有限穩(wěn)定性的問題以及擴大其應用領(lǐng)域，這些特殊的性質(zhì)包括耐熱性、耐鹽性、穩(wěn)定性強等[2]。極端微生物是最適生活在極端環(huán)境中的微生物的總稱，包括嗜熱、嗜冷、嗜鹽、嗜酸、嗜堿、嗜壓等多種類型。極端微生物通常具有獨特的生理機制及代謝產(chǎn)物，能夠提供豐富的極端酶資源。

嗜鹽古菌是一類通常生活在鹽湖、曬鹽場、腌制食品等高鹽環(huán)境中的極端微生物，與大部分極端微生物相比，具有易培養(yǎng)、生長快等特點，在生物技術(shù)方面具有廣泛的應用前景[3]。從自然環(huán)境中篩選具有優(yōu)良酶學性質(zhì)的嗜鹽古菌胞外蛋白酶成為近年來國內(nèi)外學者的研究熱點。DAMMAK等人從突尼斯的斯法克斯曬鹽場分離得到1株高產(chǎn)胞外蛋白酶的嗜鹽古菌HalorubrumezzemoulenseETR14，并報道了其蛋白酶耐鹽堿、熱穩(wěn)定的特征[4]。ELBANNA等人從位于埃及法尤姆美利斯湖的Emisal鹽業(yè)公司的粗制鹽中分離獲得一株產(chǎn)蛋白酶菌株Halobacteriumsp. HP25，并發(fā)現(xiàn)其蛋白酶耐鹽堿、耐熱，并且能夠耐受一定的有機溶劑和表面活性劑[5]。AKOLKAR等人從印度坎德拉鹽田的鹵水樣品中分離獲得Halobacteriumsp. SP1(1)菌株，研究了其胞外蛋白酶酶學性質(zhì)[6]，并將其用于改良傳統(tǒng)魚露發(fā)酵工藝，縮短魚露發(fā)酵時間[7]。我國學者石萬良等人對分離自湖北應城鹽礦的Natrinemasp. R6-5菌株所產(chǎn)胞外蛋白酶進行了純化以及酶學性質(zhì)表征[8]，高瑞昌等人研究了分離自江蘇如東鹽田的HalogranumrubrumRO2-11菌株的胞外蛋白酶性質(zhì)[9]。然而，相對于豐富的高鹽環(huán)境和嗜鹽古菌資源，對其胞外蛋白酶的研究尚處于起步階段，尤其是對反應條件要求不嚴格的蛋白酶資源仍有很大挖掘空間[5]。

本研究從分離自我國內(nèi)蒙古柴達敏鹽湖的嗜鹽古菌中篩選高產(chǎn)胞外蛋白酶菌株，并對所產(chǎn)蛋白酶的酶學性質(zhì)進行初步研究，為進一步分離純化及工業(yè)應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

39株嗜鹽古菌分離自內(nèi)蒙古柴達敏鹽湖。

酵母提取物、魚蛋白胨：OXOID試劑公司；脫脂奶粉、酪蛋白、PCR擴增試劑盒：上海生工生物技術(shù)服務有限公司；其他試劑：國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

NHM培養(yǎng)基成分(g/L)：酵母提取物0.05，魚蛋白胨0.25，丙酮酸鈉1.0，KCl 5.4，CaCl20.29，NH4Cl 0.27，MgSO4·7H2O 26.8，MgCl2·6H2O 23.0，NaCl 184.0，K2HPO40.3，pH 7.0。AHM培養(yǎng)基成分(g/L)：酵母提取物0.05，魚蛋白胨0.25，丙酮酸鈉1.0，KCl 5.4，NaNO30.5，CaCl20.1，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 184.0，pH 9.0。固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂。

本研究使用的緩沖液包括50 mmol/L磷酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 6.0)，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0、8.0、9.0)，50 mmol/L硼砂-氫氧化鈉緩沖液(pH 10.0、11.0)，以及含有不同濃度NaCl的相應pH的緩沖液。

1.2　儀器與設備

電子天平：上海精科天平儀器廠；pHS-3TC型酸度計：上海天達儀器有限公司；全自動滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；HBA-1151PCR儀：MJ Research公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；HYG-C型多功能搖床：太倉實驗設備廠；Avanti J-14離心機：Beckman公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；DU800TM核酸蛋白分析儀：Beckman-Coulter公司。

1.3　方法

1.3.1產(chǎn)胞外蛋白酶菌株篩選

CDM1～CDM12這12株嗜鹽古菌經(jīng)NHM培養(yǎng)基活化，CDA1～CDA27這27株嗜鹽古菌經(jīng)AHM培養(yǎng)基活化。配制含5 g/L脫脂奶粉的NHM或AHM平板，取5 μL活化后的菌液接種到脫脂奶粉平板，于37 ℃培養(yǎng)4 d形成明顯的菌苔。產(chǎn)胞外蛋白酶菌株的菌苔周圍有透明圈，否則，沒有透明圈。根據(jù)透明圈直徑與菌苔直徑之比初步評價產(chǎn)蛋白酶能力。

1.3.216S rRNA基因序列分析

取少量菌體加入30～50 μL無菌水，沸水浴10 min裂解細胞，作為PCR模板。引物0018F和1518R用于擴增16S rRNA基因[10]。PCR產(chǎn)物測序由北京諾賽基因組研究中心完成。NCBI BLAST用于基因序列分析。

1.3.3粗酶液的制備

CDM1～CDM12這12株嗜鹽古菌經(jīng)NHM培養(yǎng)基活化，CDA1～CDA27這27株嗜鹽古菌經(jīng)AHM培養(yǎng)基活化，以2%的比例接種于200 mL NHM或AHM培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。于4 ℃，9 000×g離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，再采用截留分子量為10 kDa的超濾離心管(Millipore)濃縮10倍，即得粗酶液。

1.3.4蛋白酶活力的測定

參照福林酚法測定蛋白酶活力[11]。稱取2.00 g酪蛋白，加入70 mL緩沖液和100 μL 10 mol/L NaOH溶液，沸水浴加熱至酪蛋白完全溶解，定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH值至緩沖液相應的值，即得酪蛋白溶液。

將25 μL酶液用緩沖液稀釋10倍至250 μL后，加入250 μL相應緩沖液配制的酪蛋白溶液，一定溫度下反應30 min，加入500 μL 100 g/L三氯乙酸溶液終止反應。37 ℃放置30 min后，于4 ℃，9 000×g離心10 min，向500 μL上清液中加入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和0.5 mL 33%福林酚試劑，40 ℃顯色20 min，于4 ℃，9 000×g離心10 min，于680 nm測定上清液的吸光度?？瞻讓φ辗磻w系即在酶液中先加入三氯乙酸溶液，后加入酪蛋白溶液。蛋白酶將酪蛋白水解成酪氨酸等物質(zhì)，利用酪氨酸標準曲線，得到酪氨酸的量計算蛋白酶活力。1個酶活力單位(U)定義為特定反應條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量。

1.3.5酶學性質(zhì)的研究

1.3.5.1最適反應溫度

將25 μL酶液用2 mol/L NaCl，pH 7.0緩沖液稀釋10倍至250 μL后，分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃下反應，測定酶活力。

1.3.5.2熱穩(wěn)定性

將25 μL酶液用2 mol/L NaCl，pH 7.0緩沖液稀釋10倍至250 μL后，在30、50、70、90 ℃下分別放置0、20、40、60 min，在最適溫度下測定酶活力。

1.3.5.3最適反應pH

分別用含2 mol/L NaCl的pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍至250 μL后，在最適溫度下測定酶活力。

1.3.5.4最適反應NaCl濃度

分別用含有0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mol/L NaCl的緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍至250 μL后，在最適溫度、最適pH下測定酶活力。

1.3.5.5NaCl濃度穩(wěn)定性

分別用含有0、1.0、2.0、3.0 mol/L NaCl的緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍至250 μL后，在30 ℃放置0、20、40、60 min，隨后分別與250 μL含3.0、2.0、1.0、0 mol/L NaCl的酪蛋白溶液在最適溫度、最適pH下測定酶活力。

1.3.5.6抑制劑對蛋白酶活力的影響

用最適緩沖液將25 μL酶液稀釋10倍至250 μL后，分別加入1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、1 mmol/L對氯汞苯甲酸(p-chloromercuribenzoic acid，PCMB)、5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、0.1 mmol/L胃蛋白酶抑制劑(pepstatin A)，30 ℃放置20 min，在最適條件下測定酶活力。對照反應體系不加抑制劑。

1.4　數(shù)據(jù)分析

酶學性質(zhì)研究所有試驗均測定3次，以“平均值±標準差”表示。采用SPSS 18.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和事后檢驗(Turkey法)，p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果與分析

2.1　產(chǎn)胞外蛋白酶菌株的篩選

從表1可以看出，分離自內(nèi)蒙古柴達敏鹽湖的39株嗜鹽古菌中，8株能夠在NHM或AHM-脫脂奶粉平板上產(chǎn)生水解圈。16S rRNA基因序列分析表明CDA5、CDA6、CDA14、CDA16和CDA17與HalovivaxcerinusIC35菌株的16S rRNA基因序列的相似性為95%～96%。CDM10與NatribaculumlongumTRM20345 的16S rRNA基因序列的相似性為93%。CDM12與HalovariusluteusDA50的16S rRNA基因序列的相似性為95%。CDA27與NatronorubrumtexcoconenseJCM 17497的16S rRNA基因序列的相似性為99%。通常16S rRNA基因序列相似性小于98.65%認為屬于不同的種[12]，相似性小于95%認為屬于不同的屬[13]。因此，除了CDA27外，其他7株菌可能為新的分類單元。

8株菌水解圈直徑與菌苔直徑的比值范圍為2.29～4.72，其中CDM10和CDM12比值在4.0以上。將這8株菌進行搖瓶發(fā)酵，在2 mol/L NaCl、35 ℃、pH 7.0的條件下測定酶活，CDM10和CDM12的蛋白酶活力分別為11.1和14.3 U/mL，其他菌株的酶活力均低于10 U/mL。因此，CDM10和CDM12用作進一步研究對象?？偟膩碚f，水解圈直徑與菌苔直徑的比值和液體發(fā)酵蛋白酶活的高低大致呈正相關(guān)。

表1　產(chǎn)胞外蛋白酶菌株Table 1　Extracellular protease-producing haloarchaeal strains

2.2　CDM10和CDM12胞外蛋白酶酶學性質(zhì)研究

2.2.1最適反應溫度與熱穩(wěn)定性

從圖1可以看出，CDM10和CDM12的蛋白酶在35～80 ℃內(nèi)均有酶活，隨著溫度升高，酶活先增加后降低。CDM10的蛋白酶最適反應溫度為70～75 ℃(p>0.05)，在65～80 ℃內(nèi)具有較高酶活(最高酶活的80%以上)。CDM12的蛋白酶最適反應溫度為60～75 ℃(p>0.05)，在55～75 ℃內(nèi)具有較高酶活(最高酶活的80%以上)。因此，CDM10和CDM12的胞外蛋白酶均具有良好的耐熱性，其中CDM10的蛋白酶在55～70 ℃內(nèi)酶活仍然隨著溫度升高迅速增加，而CDM12的蛋白酶在此溫度范圍內(nèi)酶活緩慢增加。

圖1　CDM10和CDM12蛋白酶的最適反應溫度Fig.1　The optimum temperature for protease activitiesof CDM10 and CDM12

從圖2可以看出，CDM10的蛋白酶在30、50 ℃具有良好的穩(wěn)定性(p>0.05)，在70、90 ℃隨著處理時間增加酶活略有降低(p<0.05)。70 ℃處理60 min后酶活降低13.2%，90 ℃處理60 min后酶活降低17.6%。CDM12的蛋白酶在30、50℃具有良好的穩(wěn)定性(p>0.05)，在70、90 ℃隨著處理時間延長酶活略有降低(p<0.05)。70 ℃放置60 min后酶活降低19.0%，90 ℃放置60 min后酶活降低30.1%。因此，CDM10和CDM12的胞外蛋白酶具有較好的熱穩(wěn)定性，CDM10胞外蛋白酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于CDM12。蛋白酶良好的熱穩(wěn)定性對于工業(yè)應用非常重要，因為很多工業(yè)過程均需在一定的溫度維持較長時間。

圖2　不同溫度處理對CDM10(a)和CDM12(b)蛋白酶活力的影響Fig.2　Effect of pre-incubation at different temperatureson protease activities of CDM10 (a) and CDM12 (b)

2.2.2最適反應pH

從圖3可以看出，CDM10和CDM12的蛋白酶在pH 6.0～11.0范圍內(nèi)均具有催化活性，隨著pH升高，酶活先升高后降低。CDM10蛋白酶的最適反應pH為8.0～9.0(p>0.05)。pH 6.0時的酶活為最高酶活的43.5%；pH 11.0時的酶活最低，為最高酶活的16.5%。CDM12蛋白酶的最適反應pH為7.0～9.0(p>0.05)。pH 6.0時的酶活為最高酶活的60.1%；pH 11.0時的酶活最低，為最高酶活的42.4%?？偟膩碚f，CDM10的胞外蛋白酶比CDM12的蛋白酶對pH的變化更敏感。

圖3　CDM10和CDM12蛋白酶的最適反應pHFig.3　The optimum pH for protease activities ofCDM10 and CDM12

2.2.3最適反應NaCl濃度與鹽度穩(wěn)定性

從圖4可以看出，CDM10和CDM12的蛋白酶在0.0～3.0 mol/L NaCl濃度范圍內(nèi)均具有催化活力，隨著NaCl濃度升高，酶活先升高后下降。CDM10蛋白酶的最適反應NaCl濃度為1.5 mol/L，在1.0～2.0 mol/L NaCl濃度范圍內(nèi)具有較高活性(最高酶活的80%以上)。NaCl濃度為0.0 mol/L時的酶活為最高酶活的60.6%，NaCl濃度為3.0 mol/L時的活性為最高活性的48.0%。CDM12蛋白酶的最適反應NaCl濃度為1.5～2.5 mol/L(p>0.05)，在1.0～3.0 mol/L NaCl濃度范圍內(nèi)均具有較高活性(最高酶活的80%以上)。NaCl濃度為0.0 mol/L時的酶活為最高酶活的45.4%。因此，CDM10和CDM12的蛋白酶具有較廣的鹽濃度適應性。

圖4　CDM10和CDM12蛋白酶的最適反應NaCl濃度Fig.4　The optimum NaCl concentration for proteaseactivities of CDM10 and CDM12

從圖5可以看出，CDM10和CDM12的胞外蛋白酶在0.0、1.0、2.0、3.0 mol/L NaCl中均具有良好的穩(wěn)定性(p>0.05)，暗示其對低鹽和高鹽濃度均有較好的耐受性。普通蛋白質(zhì)在高鹽環(huán)境中會發(fā)生鹽析沉淀從而變性失活，嗜鹽古菌蛋白質(zhì)獨特的結(jié)構(gòu)特征使得能夠在高鹽環(huán)境中發(fā)揮活性，即主要通過增加表面酸性氨基酸殘基的比例以形成負電屏蔽，從而在蛋白周圍形成一層水化層來維持高鹽環(huán)境中的活性和穩(wěn)定性[14]。然而，目前報道的很多嗜鹽古菌胞外蛋白酶，如HalogeometricumborinquenseTSS101[15]、Natronococcusoccultus[16]的胞外蛋白酶，僅在高鹽濃度下具有活性，在低鹽濃度下會失活。CDM10和CDM12蛋白酶廣泛的鹽濃度適應性將使其在高鹽或低鹽工業(yè)中均能發(fā)揮作用。

圖5　不同NaCl濃度處理對CDM10(a)和CDM12(b)蛋白酶活力的影響Fig.5　Effect of pre-incubation at different NaCl concentrationson protease activities of CDM10 (a) and CDM12 (b)

2.2.4抑制劑對蛋白酶活性的影響

根據(jù)活性中心的功能基團，蛋白酶主要分為天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶[17]。為了探究CDM10和CDM12胞外蛋白酶種類，分別測定不同的蛋白酶抑制劑對胞外蛋白酶酶活的影響。從圖6可以看出，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF使CDM10和CDM12胞外蛋白酶活性分別降低了94.4%和90.7%。

圖6　抑制劑對CDM10(a)和CDM12(b)蛋白酶活力的影響Fig.6　Effect of inhibitors on protease activities ofCDM10 (a) and CDM12 (b)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑PCMB使CDM10和CDM12胞外蛋白酶活力分別降低了47.0%和65.9%。金屬蛋白酶抑制劑EDTA可能通過螯合金屬離子使酶活性中心失去輔因子從而使CDM10和CDM12胞外蛋白酶活力分別降低了33.0%和60.4%。天冬氨酸蛋白酶抑制劑pepstatin A對酶活沒有顯著影響(p>0.05)。這些結(jié)果表明CDM10和CDM12的胞外蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，半胱氨酸和金屬離子對于蛋白酶活性的發(fā)揮具有重要的作用。

3　結(jié)論

本研究從分離自內(nèi)蒙古柴達敏鹽湖的39株嗜鹽古菌中篩選出8株產(chǎn)胞外蛋白酶菌株，16S rRNA基因序列分析表明其中7株可能為新的分類單元，暗示著我國高鹽環(huán)境中蘊藏著豐富的嗜鹽古菌蛋白酶資源。CDM10和CDM12產(chǎn)蛋白酶能力最強，其蛋白酶具有良好的熱穩(wěn)定性，對低鹽和高鹽濃度均有較好的耐受性，因而具有廣泛的應用前景。嗜鹽古菌蛋白酶酶學特性的研究能夠為其在工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的應用奠定基礎。

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