丁琳,王真，鄭德娟，程磊，曹雁平*

1(北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京，100048)2(北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京，100048)

固定化酶是指能夠固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)可以進行催化反應(yīng)的酶[1]，具有穩(wěn)定性好、易分離、產(chǎn)物收率高和使用效率高等優(yōu)點[2]。但由于固定化酶存在的立體屏蔽、微擾動、分配效應(yīng)以及擴散限制效應(yīng)等會導(dǎo)致表觀酶活較低[3]。超聲具有化學(xué)效應(yīng)、熱效應(yīng)、機械效應(yīng)、空化效應(yīng)等特點，同時又具有安全環(huán)保、節(jié)能高效等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用[4]。WANG 等[5]發(fā)現(xiàn)超聲輔助能夠提高固定化酶的活力，并且加快酶解過程，超聲處理后的水解度增加74.38%。LADOLE[6]等研究超聲功率對固定化纖維素酶的影響時發(fā)現(xiàn)，在24 kHz超聲波條件下，6 W功率和6 min的孵育時間，固定化纖維素酶的催化活性比對照組增加了近3.6倍。殼聚糖作為一種天然高分子材料，常以凝膠或多孔微球的形態(tài)通過吸附或者包埋[7]的方法進行固定化[8]。EDWARDS[9]等將殼聚糖制成凝膠狀膜，利用其吸附能力提高酶的固定效率。木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[10]。

超聲能夠提高固定化酶的酶活，使固定化酶的反應(yīng)活化能等發(fā)生變化。林勤保[11]等發(fā)現(xiàn)，用頻率為0.88 kHz的超聲波處理肌酸激酶、丙酮酸鹽激酶等固定化酶時，固定化酶的反應(yīng)速率明顯增加。周澍堃[12]等發(fā)現(xiàn)，與非超聲相比，超聲可以降低活化能，使降解反應(yīng)更容易發(fā)生。但因為酶的種類不同，固定化方法與固定化材料的不同，其化學(xué)動力學(xué)參數(shù)難以定量分析并概括。故必須通過實驗具體測定并總結(jié)[13]。

1　實驗材料與方法

1.1　材料與試劑

試劑：木瓜蛋白酶，Sigma公司；殼聚糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸、NaOH、干酪素、L-谷胱甘肽、無水Na2CO3、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、三氯乙酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；福林酚，上海源葉生物科技有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

JXD-02型超聲波電源，北京金星超聲波設(shè)備技術(shù)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋、恒溫磁力攪拌器,國華電器有限公司；超聲波清洗機，南京先歐生物科技有限公司；電子天平，DENVER INSTRUMENT；紫外分光光度計，日本島津公司；低溫恒溫槽，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3　實驗方法

1.3.1固定化木瓜蛋白酶的制備

稱取0.65 g殼聚糖溶于20 mL、0.9%HAc溶液中，置于60 ℃的恒溫磁力攪拌鍋中攪拌至殼聚糖完全溶解，呈透明無氣泡的膠狀溶液。然后加入0.01 g木瓜蛋白酶粉末，繼續(xù)攪拌約5 min至酶溶解，將此混合液取出后冷卻到室溫。用一次性滴管將制備好的混合液緩慢滴入不斷攪拌的1.1%的NaOH溶液中，使其固定化呈小球狀，置于4 ℃的冰箱冷藏20 min后取出，用大量去離子水清洗小球至無NaOH殘留，然后將小球置于干凈的濾紙上晾干備用。制備好的小球置于4 ℃的冰箱中保存。

1.3.2固定化木瓜蛋白酶活性的測定

利用Folin-酚法測定固定化木瓜蛋白酶的表觀酶活力。

1.3.3固定化木瓜蛋白酶反應(yīng)級數(shù)的確定

對于反應(yīng)aA+bB=dD+eE，實驗測得其速率方程式為：

v=k(A)m(B)n

(1)

式中：k為反應(yīng)速率常數(shù)；m為反應(yīng)物A的級數(shù)；n為反應(yīng)物B的級數(shù)；(m+n)為反應(yīng)的級數(shù)，反應(yīng)級數(shù)越大，表示濃度對反應(yīng)速率的影響越大。

對反應(yīng)速率方程進行積分，得到濃度與時間t的函數(shù)關(guān)系式，成為化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)方程式。對于反應(yīng)A→B，零級反應(yīng)符合式(2)，一級反應(yīng)符合式(3)，二級反應(yīng)符合式(4)。

CA=-kt+CA0

(2)

lnCA=-kt+lnCA0

(3)

1/CA=1/CA0+kt

(4)

式中：CA為t時刻酪蛋白被固定化木瓜蛋白酶水解后的剩余質(zhì)量濃度，mg/mL；CA0為t=0時刻酪蛋白的質(zhì)量濃度，mg/mL。

對于零級、一級、二級反應(yīng)，分別對C-t、ln(C0/C)-t、(1/C-1/C0)-t做直線，通過最小二乘法對數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，其相關(guān)系數(shù)為最大值的直線所對應(yīng)的方程即為該反應(yīng)的速率特征方程，所對應(yīng)的反應(yīng)級數(shù)分別為零級、一級、二級。

1.3.4固定化木瓜蛋白酶化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定

利用Arrhenius方程：

(5)

式中：k為反應(yīng)速率常數(shù)；Ea表示表觀活化能；A表示指前因子；R為摩爾氣體常數(shù)；T為反應(yīng)溫度。

根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)，lnk對1/T作圖，根據(jù)lnk與1/T線性的斜率和截距可以求出表觀活化能Ea和指前因子A。

2　結(jié)果與分析

2.1　固定化木瓜蛋白酶反應(yīng)級數(shù)的確定

配置pH 7下初始質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL的底物(酪蛋白)溶液，分別置于40 ℃的恒溫水浴以及超聲條件下處理60 min，每10 min取樣測定酶活力。根據(jù)實驗結(jié)果，分別對C-t、ln(C0/C)-t、(1/C-1/C0)-t作圖，得出酪蛋白在相應(yīng)反應(yīng)級數(shù)下的酶解速率常數(shù)k，并進行線性回歸分析。結(jié)果如表1所示。

表1數(shù)據(jù)顯示，超聲與非超聲條件下ln(C0/C)-t的回歸方程斜率均相差最小，由此說明，一級反應(yīng)動力學(xué)較零級、二級反應(yīng)更能明確地描述固定化木瓜蛋白酶酶解酪蛋白的反應(yīng)規(guī)律。因此，可以初步確定，酪蛋白被固定化木瓜蛋白酶酶解的反應(yīng)符合一級反應(yīng)動力學(xué)特性。這與相關(guān)研究文獻所報道結(jié)果一致[15]。

表1　不同條件下酪蛋白濃度隨時間的變化的零級、一級和二級反應(yīng)的回歸方程Table 1　The equation of zero,primary and secondaryreactions of casein concentration with time underdifferent conditions

2.2　固定化木瓜蛋白酶的化學(xué)動力學(xué)研究結(jié)果

將固定化木瓜蛋白酶分別在30、40、50、60、70 ℃的恒溫水浴條件以及不同超聲條件下與10 mg/mL的底物(酪蛋白)反應(yīng)60 min，每隔10 min取樣測定酶活力，超聲條件見表2。

2.2.1超聲對固定化木瓜蛋白酶化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)的影響

圖1、圖2為各溫度下的一級反應(yīng)速率方程，在非超聲與超聲條件下，固定化木瓜蛋白酶的反應(yīng)速率常數(shù)均隨溫度的升高而增大，且超聲條件下固定化木瓜蛋白酶催化效果較非超聲條件下更加明顯。

表2超聲處理固定化木瓜蛋白酶化學(xué)動力學(xué)的實驗設(shè)計

Table2Experimentdesignofstudyingkineticsofultrasonictreatedimmobilizedpapain

頻率/kHz功率/(W·cm-2)溫度/K溫度/℃280.0530330400.1531340500.25323501350.35333600.4534370

這說明溶液中酪蛋白分子的運動速率隨溫度的升高而增大，增加了酪蛋白與木瓜蛋白酶的接觸機會，從而加快了反應(yīng)的進行。磨建新[16]在探討溫度對化學(xué)反應(yīng)速度的影響時發(fā)現(xiàn)，溫度每升高10 ℃反應(yīng)速度大約加快2～4倍。均說明反應(yīng)速率對溫度很敏感，在一定的反應(yīng)條件下升高溫度可以促使活化分子數(shù)目增多，加快反應(yīng)進程。

2.2.2超聲對固定化木瓜蛋白酶化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的影響

為進一步研究超聲影響固定化木瓜蛋白酶水解反應(yīng)的規(guī)律，需要探討表觀活化能以及指前因子的變化。結(jié)果如表3所示。

圖1　超聲頻率對固定化酶酶解速率的影響Fig.1　The effect of ultrasonic frequency on reactionrate of immobilized enzyme

圖2　超聲功率對固定化酶酶解速率的影響Fig.2　The effect of ultrasonic power on reactionrate of immobilized enzyme

超聲條件lnk-1/T方程Ea/(kJ·mol-1)AR2非超聲y=-8271.2x+18.05468.84±1.98833426800.9804頻率/kHz284050135y=-5589.46x+10.18y=-5320.9x+9.43y=-4954.3x+8.22y=-4551.34x+7.1946.32±0.13a44.04±0.22b41.13±0.32c38.23±0.53d2501210977362715600.98660.98140.98810.05y=-4551.34x+7.1938.23±0.53c15600.98370.15y=-4367.3x+6.9736.31±0.45d10760.9802功率/(W·cm-2)0.25y=-3963.8x+5.7932.81±0.09e3070.99010.35y=-4846.5x+8.37540.29±0.39b43620.97690.45y=-5106.3x+9.0842.45±0.26a87940.9944

表3數(shù)據(jù)顯示，超聲能顯著(p<0.05)降低表觀活化能。當(dāng)超聲功率為0.05 W/cm2時，隨著超聲頻率的增加，表觀活化能Ea逐漸減小。當(dāng)超聲條件為135 kHz，0.05 W/cm2時，表觀活化能最小為38.23±0.53 kJ/mol。超聲頻率增加，空化氣泡數(shù)量呈線性增加，產(chǎn)生大量的沖擊波能高頻率的進入固定化酶的小縫隙中，增加了木瓜蛋白酶與酪蛋白的接觸機會。同時，超聲波產(chǎn)生的瞬間破壞力使殼聚糖載體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)打開，減少了酪蛋白與產(chǎn)物分子在通道中受到的阻力，從而加速了催化反應(yīng)[17]。

當(dāng)超聲頻率為135 kHz，超聲功率從0.05 W/cm2增加到0.25 W/cm2時，表觀活化能持續(xù)降低，到0.25 W/cm2時為32.81±0.09 kJ/mol。其原因可能為，超聲功率增大，超聲波強度增加，空化效果明顯，產(chǎn)生的剪切力改變固定化酶的結(jié)構(gòu)[18]，或者使得木瓜蛋白酶活性位點暴露，能夠充分與底物結(jié)合，從而加速了反應(yīng)速率。但是，超聲功率從0.25 W/cm2升至0.45 W/cm2時，表觀活化能出現(xiàn)上升趨勢。此現(xiàn)象可以從3方面進行解釋：

(1)在高超聲頻率條件下，當(dāng)超聲功率達到一定值后，空化趨于飽和，隨著超聲功率增加而產(chǎn)生的大量無用空化氣泡，在聲波的振動下，空化核急劇崩潰閉合產(chǎn)生大量散射強度，形成瞬時壓力，阻礙產(chǎn)物釋放，造成反應(yīng)通道堵塞，降低了空化強度與反應(yīng)速率[19]。

(2)超聲強度增加，一定程度上會導(dǎo)致酶分子構(gòu)象改變。超聲波對酶活性部位的接觸殘基施加影響，導(dǎo)致酶失活[19-20]。超聲強度的增加有抑制作用。

(3)超聲的熱作用[21]。超聲條件下振動的能量不斷被媒質(zhì)吸收轉(zhuǎn)化為熱量，并且功率越高，產(chǎn)生的熱量也會越高[22]，使得媒質(zhì)溫度也隨之升高，導(dǎo)致氣泡中蒸汽壓增大，瞬間爆破時受到阻礙，使得產(chǎn)生的沖擊波能量較小，減緩了催化反應(yīng)，使催化反應(yīng)不易進行。

以上數(shù)據(jù)顯示，表觀活化能以及指前因子均會隨不同超聲條件有所改變。理論上活化能越低，反應(yīng)速率越大，活化分子碰撞速率越高，相對應(yīng)的指前因子數(shù)值越大。但是實驗結(jié)果顯示，指前因子A的大小隨著表觀活化能Ea的增大而增大，隨著Ea的減小而減小。出現(xiàn)這種情況的原因可能是[23]：在均相或多項反應(yīng)中(不同溶劑中的液相反應(yīng)、催化劑組成有規(guī)律變化或表面預(yù)處理不同的多相反應(yīng)、同類無機鹽或有機高聚物的熱分解反應(yīng)等)，常會存在補償效應(yīng)，即指前因子A會隨著Ea的增大而增大，隨著Ea的降低而減小，也就是說表觀活化能與指前因子對反應(yīng)速率起相反的影響，這種關(guān)系稱為動力學(xué)補償效應(yīng)或動力學(xué)效應(yīng)。殼聚糖固定化木瓜蛋白酶水解酪蛋白催化反應(yīng)的體系復(fù)雜，因此，對于復(fù)雜體系以及復(fù)雜分子的化學(xué)反應(yīng)而言，需要考慮補償效應(yīng)。

3　結(jié)論

通過超聲處理殼聚糖固定化木瓜蛋白酶的動力學(xué)結(jié)果可以看出：酪蛋白被固定化木瓜蛋白酶酶解反應(yīng)符合一級的反應(yīng)動力學(xué)特征。在研究殼聚糖包埋固定化木瓜蛋白酶催化酪蛋白的化學(xué)動力學(xué)中，溫度對催化反應(yīng)有直接作用，隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)速率常數(shù)k隨之增大。在固定功率時，表觀活化能隨超聲頻率的升高而減小，可見增大超聲頻率對反應(yīng)有促進作用。在固定頻率時，增加超聲強度，表觀活化能Ea先減小后增大，說明一定的超聲功率對固定化木瓜蛋白酶催化反應(yīng)有一定抑制作用。135 kHz，0.25 W/cm2超聲條件下，表觀活化能最小，即參加反應(yīng)的活化分子數(shù)量最多，酶促反應(yīng)最容易進行。

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