許樂，李函彤，逄曉陽，張書文，蘆晶，呂加平*，劉鷺*

1(中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，農業(yè)部農產品加工與質量控制重點開放實驗室，北京，100193)2(石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司，河北 石家莊，050031)

葡萄糖耐量因子(glucose tolernace factor, GTF)是由微量元素鉻、煙酸、甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等成分組成的小分子蛋白復合物，具有水溶性，在A260有紫外吸收峰[11]，不被蛋白酶水解。GTF具有增強胰島素功能，促進糖代謝和脂代謝，逆轉葡萄糖耐受不良，提高糖耐量；保護胰島素β細胞，提高胰島素受體數量及其親和力等功能[12-13]。機體GTF缺乏與Ⅱ型糖尿病的形成有較為密切的關系。我國18歲及以上居民糖尿病患病率約為9.7%。鉻缺乏是糖尿病的重要誘因之一。人體只能通過食物來攝取鉻。但食物精制加工、高糖飲食、衰老等生理應激都會加劇組織中鉻的流失，造成現代人普遍性鉻缺乏。即使是營養(yǎng)學家所設計的完全平衡化的營養(yǎng)膳食也不能保證提供50 μg/d鉻的攝入量。所以，通過營養(yǎng)強化劑對特定人群進行強化補鉻是一條有效途徑。目前，我國已將鉻(硫酸鉻、氯化鉻)作為營養(yǎng)強化劑用于特殊膳食用食品的加工(GB14880—2012)。這2種鉻屬于無機鉻。相比于無機三價鉻的0.5%～2%吸收率，有機鉻的吸收率可達10%～25%，生物來源的GTF、低分子量鉻附合物(low-molecular-weight chromium-binding substance, LMWCr)吸收率和生物活性會更高。作為酵母代謝產物的GTF與動物體內鉻調素(chromodulin)一樣，同屬經生物有機轉化的金屬蛋白，保守性和安全性較高，沒有降糖西藥的相關副作用，勢必成為糖尿病患者的重要保健食品。因此厘清GTF中鉻的價態(tài)對于未來GTF保健食品的開發(fā)以及酵母資源的深度加工有重要的意義。

酵母具有吸附金屬的能力。本研究中酵母通過生物吸附和生物轉化作用將環(huán)境中的無機鉻轉化為體內鉻蛋白復合物質——GTF。NEILE[14]等通過反相層析提取，體外脂肪細胞培養(yǎng)鑒定活性成分，采用31P核磁共振對3個分離組分進行組成和結構分析，發(fā)現組分中含有多種有機磷酸鹽、無機磷酸鹽和聚磷酸鹽類物質。王翀[15]利用紫外光譜和紅外光譜研究鉻在酵母細胞中的賦存形式。本研究在前期氨水提取基礎上，優(yōu)化有機溶劑提取條件，通過聯用溶劑提取及分子篩純化，得到純度相對較高的GTF樣品，旨在獲得用于鉻價態(tài)分析的GTF高純度樣品。由于酵母中GTF含量較少，提取過程步驟較多， GTF損失較高，因此本研究采用靈敏度高的檢測技術HPLC-ICP-MS對純化后的GTF中的鉻價態(tài)進行分析，以期為安全膳食鉻補充劑的篩選提供理論依據。HPLC-ICP-MS聯用技術具有檢出限低、動態(tài)線性范圍寬(0 ppb～1 000 ppm)、分析時間短、應用范圍廣等優(yōu)點[16-19]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

啤酒酵母菌YSI-3.7，實驗室保藏菌株；三氯化鉻，國藥集團化學試劑有限公司；氨水(分析純)，北京市化學試劑公司；SuperdexTM75、Sephadex G25，美國GE公司；Bio-WAX Column，日本安捷倫公司；鉻(Ⅲ)標準液(1 000 μg/mL)，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；鉻(Ⅵ)標準液(1 000 μg/mL)， 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；鉻標準液(1 000 μg/mL)，中國計量科學院；乙二胺四乙酸(色譜純)，美國Sigma公司。

1.2　儀器與設備

1525型高效液相色譜儀，美國Waters公司；MB-102型恒溫金屬浴，日本BIOER公司；DRC-e型電感耦合等離子體質譜儀，美國PerkinElmer公司；Bio-WAX色譜柱，美國Agilent公司；3K15冷凍離心機，美國Sigma公司。

1.3　制備富鉻酵母菌粉

挑取在1 000 μg/mL的鉻濃度平板上長出的YSI-3.7優(yōu)勢菌落，接種于鉻含量為500 μg/mL的培養(yǎng)液中發(fā)酵44 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，去離子水洗3次，冷凍干燥，制備凍干富鉻酵母菌粉。

1.4　氨水提取

將富鉻酵母菌粉與0.1 mol/L氨水以質量體積比為1∶10(g∶mL)溶解[20-21]，經37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)4 h，于10 000 r/min，4 ℃，離心30 min，收集上清液。參照1.9方法進行消化及火焰原子吸收測定。

1.5　有機溶劑提取

1.5.1有機溶劑對GTF提取效果的影響

凍干富鉻酵母菌粉經氨水提取，離心，收集上清液。取10 mL上清液數份，分別加入15 mL的甲醇、乙醇和丙酮，冰浴靜置30 min，10 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀。參照1.9方法進行消化及火焰原子吸收，測定上清液、沉淀中的鉻含量；采用考馬斯亮藍法測定上清液、沉淀部分的總蛋白。分別計算上清液和沉淀部分的總有機鉻量(μg)與總蛋白量(mg)的比值(即鉻蛋白比：每毫克蛋白中鉻的含量)，分析其提取效率。

1.5.2有機溶劑濃度對GTF提取效果的影響

取氨水提取后GTF的上清液(10 mL)，加入體積不同的乙醇，使乙醇最終體積分數分別為60%、50%、40%、30%和15%，靜置提取，同時設置無乙醇提取組為空白對照，測定上清液中有機鉻和蛋白濃度，計算上清液中總有機鉻量、總蛋白以及鉻蛋白比(μg/mg)，確定乙醇最佳作用濃度。

1.5.3有機溶劑作用時間對GTF提取效果的影響

取氨水提取后GTF的上清液，加入30%乙醇沉淀，分別靜置15、20、30 min后，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液。參照1.9方法進行消化及火焰原子吸收，測定上清液中有機鉻、蛋白濃度，計算上清液中總有機鉻量、總蛋白以及鉻蛋白比(μg/mg)，確定乙醇最佳作用時間。

1.6　SuperdexTM 75凝膠過濾層析

去離子水溶解GTF凍干菌粉，過0.22 μm膜，采用SuperdexTM75 (1.6 cm × 80 cm)凝膠過濾層析柱進行分離，以0.15 mol/L NaCl和50 mmol/L CH3COONH4混合(pH 6.0)為洗脫液，洗脫速度為0.3 mL/min，每管收集3 mL，各管洗脫液在A254吸收波處進行蛋白吸光值的測定[22]，其有機鉻含量采用火焰原子吸收法測定[23-25]，繪制有機鉻、蛋白含量雙坐標圖譜。收集鉻峰洗脫液，參照1.9方法進行消化及火焰原子吸收測定。

1.7　Sephadex G25凝膠過濾層析

將經過SuperdexTM75凝膠過濾層析后的鉻峰洗脫液凍干粉用去離子水溶解，0.22 μm膜過濾，上Sephadex G25凝膠過濾層析柱(1.0 cm×80 cm)，以去離子水為洗脫液，洗脫速度0.3 mL/min，各管洗脫液在A254吸收波處進行蛋白吸光值的測定，其有機鉻含量采用火焰原子吸收法進行測定，繪制有機鉻、蛋白含量雙坐標圖譜，收集鉻峰處洗脫液，冷凍干燥備用。

1.8　有機鉻的提取

準確稱取酵母菌粉0.1 g，溶于0.1 mol/L氨溶液中，在37 ℃、轉速為200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，參照1.9方法進行消化及火焰原子吸收測定。

1.9　樣品消化及鉻測定

將收集的上清液或沉淀置于溶樣杯中，加入6 mL質量分數為68%的濃HNO3，160 ℃預加熱30 min，待溶液稍涼后，加入0.5 mL質量分數為72%的HClO4和質量分數5%的過硫酸銨溶液5 mL，于微波消解儀中進行樣品消解，具體參數設置見表1。消解完畢后，加入1% NH4Cl溶液2.5 mL，其余用去離子水補齊至25 mL。參照 GB/T15555.6—1995方法，采用火焰原子吸收儀對樣品中的鉻量進行測定。

表1　微波消解儀消化參數表Table 1　Parameters of microwave digestion instrument

1.10　GTF鉻價態(tài)分析

由于提取、純化酵母菌中的GTF的步驟較多，極易造成有機鉻的損失，且最終得到的純化物較少，本實驗采用ICP-MS和HPLC聯用技術分析GTF 中的鉻價態(tài)。此方法具有接口簡單、檢出限低、動態(tài)線性范圍寬(0 ppb～1 000 ppm)、前處理簡便、分析時間短及應用范圍廣等優(yōu)點。參照Agilent LC-ICP-MS技術手冊進行鉻價態(tài)分析，方法略有改進。

1.10.1高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜參數

高效液相色譜參數設置：

色譜柱采用Agilent Bio-WAX Column 5 μm，4.6 mm×50 mm(5190-2488)，室溫下運行，進樣量為30 μL。流動相為0.075 mol/L NH4NO3，流速為0.6 mL/min。

電感耦合等離子體質譜參數設置：

采用玻璃同心霧化器，RF功率1 550 W，采樣深度8 mm，載氣1.2 L/min，積分時間0.8 s，52Cr，以氦氣模式4.5 mL/min，蠕動泵0.3 r/s。

1.10.2標準試劑的配制及標準曲線的繪制

緩沖液：0.075 mol/L HNO3和0.6 mmol/L EDTA，氨水調pH為7.0。

流動相：0.075 mol/L HNO3，氨水調pH至7.0。

鉻標準溶液：準確稱取0.5 g Cr(Ⅲ)和0.5 g Cr(Ⅵ)溶液，緩沖液稀釋至50 g，制成鉻混合液M1，之后用流動相將M1配置成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL混合標準系列使用液，調pH為7.0，50 ℃水浴加熱1 h，參照1.10.1的參數設置進行測定與分析(圖1)，繪制標準曲線(圖2)。

圖1　Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ) 混合標準液HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.1　Total ion flow diagram of standard chromium solutionof trivalent chromium and hexavalent chromium

圖2　鉻標準液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)峰面積標準曲線Fig.2　Chromium standard solution in peak area of standardcurve of trivalent chromium and hexavalent chromium

1.10.3GTF樣品處理

將Sephadex G25層析后收集得到的鉻峰洗脫液凍干成粉后，取0.1 g左右樣品，用3 mL 0.07 mol/L HCl溶解，37℃水浴振蕩1 h，37 ℃靜置1 h，用0.22 μm過濾膜過濾，8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入1 mL 0.07 mol/L NH3·H2O和8 mL緩沖液，于50 ℃保溫加熱1 h，使緩沖液中的EDTA和GTF 中的Cr(Ⅲ)絡和形成穩(wěn)定的絡合物。取30 μL參照1.10.1的參數設置進行HPLC-ICP-MS 的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)分析。

1.11　數據處理

2　結果與分析

2.1　氨水聯用有機溶劑提取GTF

2.1.1有機溶劑的種類對GTF提取效果的影響

文獻表明GTF可溶解于氨水、乙醇等有機溶劑[26-27]。同時在蛋白分離純化過程中，有機溶劑還具有沉淀蛋白的功能。因此本實驗在氨水提取的基礎上，選擇甲醇、乙醇和丙酮3種常見的有機溶劑繼續(xù)提取GTF，分析上清液和沉淀中的鉻絕對值和鉻蛋白比，結果如圖3、表2所示。甲醇提取后，上清液中有機鉻量為61 μg，沉淀物中有機鉻量為33 μg；乙醇提取后，其上清液和沉淀物中的有機鉻量分別為85 μg和21 μg，上清液中鉻量是沉淀物中鉻量的4倍多；丙酮提取后，其上清液和沉淀中有機鉻量分別為62 μg和23 μg，上清液中鉻量也將近是沉淀物總量的3倍。表2顯示了不同提取組分中的鉻蛋白比。鉻蛋白比指每毫克蛋白中的鉻含量，在一定程度上可用于衡量GTF提取純化的效果。其比值越高，表示雜蛋白越少，物質越純。相較于氨水提取組(對照組)，經過有機溶劑提取后，GTF中鉻蛋白比值都有所提高。其中乙醇提取的上清液中，鉻蛋白比為2.4。相比于氨水提取法的鉻蛋白比0.818，提高將近3倍。

圖3　不同有機溶劑提取對提取液中有機鉻含量及蛋白含量的影響Fig.3　Effect of organic solvent on exaction of organicchromium content and protein content

2.1.2有機溶劑濃度對GTF提取效果的影響

為確定乙醇最佳作用濃度，本實驗選取60%、50%、40%、30%、15%這5個不同濃度的乙醇提取GTF，于0 ℃冰浴靜置20 min,結果由圖4所示。

表2　不同有機溶劑對提取液中鉻蛋白比的影響　單位：μg/mg

圖4　不同乙醇體積分數對GTF提取液中有機鉻含量及蛋白含量的影響Fig.4　Effect of various ethanol concentration on exactionof organic chromium and protein content

由圖可知，其鉻蛋白的比值分別為1.077、0.812、0.59、5.015和1.412，對照組鉻蛋白比為0.804。乙醇的靜置處理有助于GTF的進一步提取。提取倍數分別為對照組的1.34、1.01、6.24、1.76倍。其中30%的乙醇濃度靜置處理，GTF的純度顯著提高。因此最終選擇30%乙醇進行GTF的提取。鉻蛋白比相較于對照組提高了6倍。

2.1.3有機溶劑靜置時間對GTF提取效果的影響

為確定乙醇最佳靜置時間，本實驗選取15、20、30、50 min作用4個時間點，結果如圖5所示。隨靜置時間的延長，上清液中鉻的含量和蛋白的含量逐漸增加。靜置20 min時，其總鉻含量最高，為133.492 μg，鉻蛋白比達到5.015；靜置30 min時，總鉻含量為120.05μg，上清液中溶解蛋白較大，為56.902 mg。總體來看，隨著靜置時間增長，蛋白溶解增加，鉻蛋白比降低。因此綜合考慮鉻蛋白比及時間，選擇靜置處理20 min，收集上清液。

圖5　靜置時間對GTF提取液中有機鉻含量及蛋白含量的影響Fig.5　Effect of various precipitation time on the extractionof organic chromium and protein content

2.2　凝膠層析聯用純化GTF

2.2.1SuperdexTM75分子篩層析

有研究報道[28-29]，GTF是分子質量為750～1 500 Da的小分子蛋白肽?；诖?，選擇SuperdexTM75進行粗提液純化，去除GTF中的大分子蛋白。結果如圖6所示。GTF粗提液經SuperdexTM75 層析，得到4個蛋白峰。其中前2個蛋白峰含鉻。蛋白峰2的鉻的含量明顯高于蛋白峰1。分子篩層析是依據蛋白分子質量不同而進行分離。大分子物質首先被洗脫。而GTF為為小分子物質，可知第2個鉻峰為目的峰。收集目的峰洗脫液，真空濃縮。

圖6　SuperdexTM 75凝膠過濾層析圖譜Fig.6　SuperdexTM 75 gel filtration chromatography

2.2.2Sephadex G25分子篩層析

收集SuperdexTM75的鉻峰，選擇分離范圍為1 000～5 000 Da的Sephadex G25進一步分離純化。 Sephadex G25是經典的葡聚糖和環(huán)氧氯丙烷偶聯介質，擁有極高的選擇性和分辨率，可對較小分子質量的蛋白有很好的分離效果。結果如圖7所示。經過凝膠層析分離得到A254蛋白峰1個，鉻峰與蛋白峰重合。由此可以得到，富鉻酵母粉經氨水和低溫低濃度乙醇提取，再經SuperdexTM75和Sephadex G25凝膠過濾層析，可以去除大量雜蛋白，得到GTF。收集鉻峰、凍干，進行鉻的形態(tài)分析。

圖7　Sephadex G25凝膠過濾層析圖譜Fig.7　Sephadex G25 gel filtration chromatography

2.3　GTF鉻價態(tài)分析

Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合標準液色譜圖(圖1)顯示Cr(Ⅲ)出峰范圍在第33～97 s；Cr(Ⅵ)在145～209 s時出峰。分別對這2個鉻峰進行面積積分，繪制Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的標曲(圖2)。對鉻峰進行面積積分，得到Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)峰面積線性方程分別為：

Cr(Ⅲ):y=20 662 800x-6 518 060

(1)

Cr(Ⅵ):y=6 745 060x+23 662 200

(2)

式中：x為洗脫時間，y為總離子峰面積。根據此方程式可以計算樣品中的鉻質量濃度。

如圖8所示，經過提取純化的GTF中有且只有1個鉻峰，于31 s出峰，90 s左右洗脫完全，出峰范圍在Cr(Ⅲ)范圍內，由此可見，GTF中存在Cr(Ⅲ)，不存在Cr(Ⅵ)。同時，根據Cr(Ⅲ)鉻峰面積線性方程，該樣品的鉻離子濃度為6.21 μg/mL，這與火焰原子吸收測得其有機鉻的含量相同，證明實驗結果可靠。但從圖8中也可看出，在67.227 s時有1個小峰出現，這個小峰與Cr(Ⅲ)的峰極為接近。同時與標液的HPLC-ICP-MS色譜圖(圖1)相比，該小峰也不屬于六價鉻的峰。因此猜測可能是由于樣品中一部分Cr(Ⅲ)與EDTA絡和結構脫離，形成不穩(wěn)定狀態(tài)所以造成圖中拖尾現象的發(fā)生。

圖8　GTF純化樣品HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.8　HPLC-ICP-MS chromatogram of GTF

3　結論

鉻(Ⅲ)是人體的基本營養(yǎng)元素之一，主要是通過激活體內鉻調素(chromodulin)來協同或增強胰島素功能而發(fā)揮作用，調節(jié)糖、脂類等正常代謝。中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量表規(guī)定三價鉻的適宜攝入量[AIs(μg)]攝入量為50 μg/d(18～50歲人群)。由于富鉻酵母中GTF的鉻價態(tài)不清，限制了富鉻酵母的深度開發(fā)及其膳食鉻補充劑的開發(fā)[30]。

富鉻酵母粉經氨水聯用乙醇提取，靜置20 min，其粗提液的總有機鉻量為133.5 μg。相比于氨水提取，鉻蛋白比提高了6倍。該粗提液經兩級分子篩凝膠層析柱分離，得到1個與鉻峰重合的蛋白峰，二者重合性較好。將此分離純化得到的GTF通過HPLC-ICP-MS聯用技術進行鉻價態(tài)分析。結果顯示鉻出峰的時間為31 ～90 s，該出峰時間與標準溶液中三價鉻的出峰時間一致。本研究結果表明，GTF中的鉻是以Cr(Ⅲ)形態(tài)存在，無Cr(Ⅵ)存在，為GTF保健食品或膳食鉻補充劑的安全開發(fā)提供了理論依據。

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