邱博韜,張鴻宇,許志茹,劉長(zhǎng)莉,王宏偉

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

多糖(polysaccharides)與核酸、蛋白質(zhì)、脂類并稱為生命體四大基本物質(zhì),在許多生命活動(dòng)中都扮演了重要的角色。隨著研究深入,其生物學(xué)活性越來(lái)越多被發(fā)現(xiàn),如:免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降低血糖、降血脂、抗病毒、清除氧化自由基、延緩衰老等。多糖廣泛存在于自然界,多源于組織細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞、機(jī)體的毒副作用小,故其是較為理想的藥物來(lái)源[13]。

1 多糖的提取

多糖通過(guò)氫鍵或離子鍵與細(xì)胞壁或胞間質(zhì)鏈接,對(duì)于不同多糖可以使用不同的提取方法。通常以熱水、酸、堿、乙醇等作為溶劑,以微波或超聲輔助進(jìn)行粗提。近年來(lái)常用的方法有超臨界流體萃取技術(shù)和復(fù)合酶輔助提取技術(shù)。其中,復(fù)合酶可以在較為溫和的條件中特異地降解細(xì)胞壁及胞內(nèi)大分子溶出的屏障,加速多糖釋放,同時(shí)根據(jù)酶的特性,反應(yīng)可以通過(guò)改變體系條件實(shí)現(xiàn)控制[4]。

但多糖提取效率不僅由提取方法決定,提取時(shí)諸如溫度、時(shí)間、次數(shù)等因素對(duì)其也有很大的影響,因此,對(duì)多因素進(jìn)行優(yōu)化便成為了提取環(huán)節(jié)的重中之重。從發(fā)展來(lái)看其研究方法,依次有單因素法、正交法和響應(yīng)面法。目前,比較準(zhǔn)確的也是被更多研究者采用的是響應(yīng)面法。響應(yīng)面法通過(guò)如Design expert的計(jì)算機(jī)軟件,可將提取率作為因變量,將提取因素作為自變量,建立多元函數(shù),并給出直觀圖像,便于選擇最優(yōu)提取方案[5]。

2 多糖的除雜

通常提取得到的粗多糖提取液,都含有如無(wú)機(jī)鹽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及低分子非極性物質(zhì)等雜質(zhì)。對(duì)于低分子量的小分子雜質(zhì)可以使用透析法濾去,汪鐸[6]等使用納濾膜DKC和DLC,得到了純度為72.4%的靈芝多糖。而蛋白質(zhì)通常用蛋白酶法、Sevag法、TCA法、三氟三氯乙烷法去除,于丹[7]等通過(guò)聯(lián)用分級(jí)醇沉和TCA法、Sevag法,處理天花粉多糖,使得除蛋白率達(dá)到了88.18%。脂肪可以用乙醇、乙醚、石油醚等有機(jī)溶劑除去。吸附、氧化是除去色素雜質(zhì)的常用方法[8]。

3 多糖的分離純化

經(jīng)過(guò)分離除雜可以得到混合多糖溶液,將其分離成各種單一多糖即是多糖的純化。實(shí)質(zhì)上,分離與純化二者并沒(méi)有明顯的界限區(qū)分，分離的同時(shí)也進(jìn)行純化,純化時(shí)進(jìn)一步發(fā)生著分離。比較常用的方法有沉降法、色譜法、區(qū)帶電泳、超速離心等生化分析方法。通常來(lái)說(shuō),多糖的純化需要兩種及以上的方法結(jié)合使用才能得到理想的效果[9]。

4 多糖分析

多糖分析,有時(shí)需要將其降解為寡糖或是單糖才方便進(jìn)行。多糖的降解方法分為物理降解、化學(xué)降解、生物降解三種。其中運(yùn)用鹽酸、硫酸或是三氟乙酸來(lái)斷裂糖苷鍵的酸水解法,操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好,是較為理想和常用的方法[10]?，F(xiàn)常用化學(xué)滴定法、比色法以及色譜法等對(duì)多糖進(jìn)行定性、定量分析。

4.1 比色法

又稱化學(xué)法,通常先將多糖降解為單糖或者寡糖,再通過(guò)紫外可見(jiàn)光分光光度法和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。不同的單糖所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同條件下的吸收值相差較大,故選用不同的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線也不同,進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果有所差異。

表1 幾種常見(jiàn)單糖的校正系數(shù)Table 1 Correction coefficients for several common monosaccharides

4.1.1 苯酚硫酸法 多糖在濃硫酸的作用下,水解為單糖并迅速脫水形成糖醛,糖醛和苯酚發(fā)生縮合反應(yīng)生成橙黃色化合物,一般可在490 nm處進(jìn)行比色測(cè)定。此法操作簡(jiǎn)單,反應(yīng)迅速靈敏,生成的有色化合物顏色穩(wěn)定性佳,是測(cè)定多糖溶液濃度的常用方法[13]。

但由于苯酚含有酚羥基,易與濃硫酸發(fā)生磺化反應(yīng),濃硫酸與糠醛衍生物競(jìng)爭(zhēng)苯酚,使得經(jīng)典苯酚硫酸法對(duì)各個(gè)顯色條件要求十分嚴(yán)格。所以此方法依舊存在著準(zhǔn)確性低(在測(cè)定有色樣品時(shí)尤為明顯)、重現(xiàn)性不佳,操作費(fèi)時(shí),消耗樣品及試劑較多等問(wèn)題。陰婉婷等[14]改變了經(jīng)典方法反應(yīng)順序:先向樣品中加入濃硫酸,使二者充分反應(yīng)生成糠醛衍生物,再加入苯酚溶液,產(chǎn)物穩(wěn)定、易于得到,準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性明顯提高。姜瓊等[15]通過(guò)預(yù)先配制顯色液然后統(tǒng)一加熱的方法,配合酶標(biāo)儀的使用在一定程度上改善了上述問(wèn)題。同時(shí),由于減少了包括濃硫酸在內(nèi)的試劑的消耗,使得實(shí)驗(yàn)的安全性得到提高。

4.1.2 蒽酮硫酸法 多糖在濃硫酸的作用下,水解為單糖并迅速脫水形成糖醛,糖醛和蒽酮反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)綠色化合物,通常在625 nm處有最大吸收值,與此進(jìn)行比色測(cè)定[16]。以此法生成的藍(lán)綠色化合物顏色穩(wěn)定性較差,同時(shí),本反應(yīng)的沸水浴時(shí)間對(duì)結(jié)果有著與糖量非線性關(guān)系的直接影響,故應(yīng)避光、迅速測(cè)量,同時(shí),色氨酸含量較高的蛋白質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)有一定的干擾,色氨酸含量較高的樣品不適用此法。劉桂茹[17]使用稀硫酸外加熱法:蒽酮試劑以稀硫酸加蒽酮配制,冰水浴中加入濃硫酸,在沸水浴中顯色的方法穩(wěn)定性佳、經(jīng)濟(jì)、易于操作,是最適合實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的方法之一。

4.1.3 3,5二硝基水楊酸(DNS)法 DNS與還原糖在堿性環(huán)境中共熱可以產(chǎn)生氨基化合物:3氨基5硝基水楊酸,顯棕紅色,且顏色深淺在一定濃度范圍內(nèi)與還原糖的量成正比,準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好,又因其能與低濃度糖樣發(fā)生反應(yīng),因而被廣泛使用[1819]。運(yùn)用時(shí)需注意,吸收光譜的波長(zhǎng)選擇、反應(yīng)時(shí)間、顯色劑用量等因素對(duì)結(jié)果有直接影響,需嚴(yán)格控制。應(yīng)用本法測(cè)得為還原糖含量,總糖和多糖含量可以通過(guò):總糖(%)=(水解后還原糖×稀釋倍數(shù)/樣品)×0.9×100[20]和多糖=總糖還原糖[21]計(jì)算。一般DNS試劑可通過(guò)DNS、NaOH和丙三醇配制得到[22]。韓德權(quán)等[23]在測(cè)定普魯羅蘭多糖發(fā)酵液中糖含量時(shí)發(fā)現(xiàn),不同濃度乙醇對(duì)DNS法測(cè)定糖含量沒(méi)有影響。但考慮到多糖種類的多樣性,不同濃度對(duì)不同多糖的影響還需要進(jìn)行系統(tǒng)研究。

4.2 滴定法

4.2.1 菲林試劑滴定法

反應(yīng)指示劑通常為亞甲基藍(lán)。亞甲藍(lán)是常用的氧化還原指示劑,其氧化型呈藍(lán)色,還原型呈無(wú)色。亞甲藍(lán)的氧化性弱于二價(jià)銅離子,故還原糖優(yōu)先與斐林試劑發(fā)生反應(yīng),當(dāng)二價(jià)銅離子都還原完后,微量的還原糖即可將亞甲藍(lán)還原,溶液藍(lán)色褪去變?yōu)闊o(wú)色,即是滴定終點(diǎn)。此滴定終點(diǎn)易受顏色干擾,故通常不使用此法測(cè)量具有較深顏色的樣品[26]。范作卿等[27]將色素含量豐富的桑葚酒進(jìn)行稀釋,較為理想地排除了色素的干擾,并利用斐林氏法測(cè)得樣品中總糖含量。本法操作簡(jiǎn)單、實(shí)際用量小、反應(yīng)快速,但同時(shí),受反應(yīng)液堿度、熱源強(qiáng)度、煮沸時(shí)間和滴定速度等的影響較大,也使得其重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性較差。減瑾康等[28]對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn),在甲液中不加入次甲基藍(lán),而是用酒石酸根合銅絡(luò)合物自身轉(zhuǎn)變?yōu)镵2CuFe(CN)6(淺黃色溶液)為滴定終點(diǎn)。此外,反應(yīng)應(yīng)嚴(yán)格在沸騰時(shí)進(jìn)行,以在加快反應(yīng)速度的同時(shí)去除溶解氧的干擾[29]。劉燁等[30]運(yùn)用物理化學(xué)方法設(shè)計(jì)的無(wú)氧滴定裝置,可以很好地克服環(huán)境中氧化劑的干擾,使結(jié)果可以更真實(shí)地反映斐林試劑與還原糖的化學(xué)計(jì)量關(guān)系。另外,隨著技術(shù)的進(jìn)步,斐林氏法也向著自動(dòng)化方向發(fā)展,以此為原理設(shè)計(jì)的還原糖測(cè)定儀,可以自動(dòng)控制反應(yīng)條件,滴定迅速,且樣品回收率高,是當(dāng)下最方便的測(cè)定還原糖的方法[31]。

4.2.1.2 高錳酸鉀法 高錳酸鉀滴定法又稱bertrand法,準(zhǔn)確度高,重現(xiàn)性好,穩(wěn)定性良好,可以用來(lái)測(cè)定斐林氏法所不能測(cè)定的有色樣液。將還原糖與斐林試劑共熱所得氧化亞銅沉淀進(jìn)行抽濾,用溫水洗滌沉淀至濾液中性,并用過(guò)量Fe2(SO4)3溶液進(jìn)行溶解,Cu2O被氧化為銅鹽,Fe2(SO4)3則被還原成亞鐵鹽。用KMnO4液(0.02 mol/L)滴定所得亞鐵溶液,通過(guò)1 mL KMnO4液=6.36 mg當(dāng)量的銅和《相當(dāng)于氧化亞銅質(zhì)量時(shí)葡萄糖、果糖、乳糖、轉(zhuǎn)化糖的質(zhì)量表》,即可求得還原糖量[32]。

4.2.1.3 薩氏法 薩氏法由Somogyi提出并以其名字命名，是一種測(cè)定還原糖的微量法,通常用于樣品量在0.015～3.000 mg的分析[33]。薩氏試劑與斐林試劑相似,區(qū)別在于薩氏試劑提供堿性環(huán)境的試劑為磷酸鈉,這使得薩氏試劑可以較長(zhǎng)時(shí)間保存。將還原糖與薩氏試劑共熱,所產(chǎn)生的Cu+可與KIO3和KI析出的I2反應(yīng),以Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)過(guò)量的I2,通過(guò)化學(xué)式便可求得還原糖含量,因此本法靈敏度高,重現(xiàn)性好,且不受有色樣品干擾。此過(guò)程中應(yīng)避免搖動(dòng)反應(yīng)容器,以防引入溶解氧或是造成碘的揮發(fā),造成誤差[34]。

4.2.2 氧化還原滴定法

4.2.2.1 碘量法 碘量法有直接碘量法和間接碘量法,直接碘量法是以淀粉溶液為指示劑,用標(biāo)定過(guò)的碘溶液滴定還原糖溶液,溶液出現(xiàn)淡藍(lán)色即為滴定終點(diǎn)。因?yàn)榈鈫钨|(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定,且間接碘量法相對(duì)于直接碘量法有著更明確的滴定終點(diǎn),因而間接碘量法更為常用[35]。還原糖在堿性條件下與碘共熱可以得到碘離子和相應(yīng)的酸,剩余的游離碘可以在堿性環(huán)境下歧化反應(yīng)為碘離子和次碘酸根離子。此時(shí)加稍過(guò)量的酸即可產(chǎn)生I2,用Na2S2O3滴定,便可以得到參與反應(yīng)的碘量。在一定范圍內(nèi),間接碘量法可以利用化學(xué)反應(yīng)式直接進(jìn)行定量計(jì)算,得出還原糖含量[36]。本反應(yīng)需注意滴定速度,滴加過(guò)快或滴定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都將造成誤差。B.曼努興[37]認(rèn)為反應(yīng)重現(xiàn)性不佳,是因?yàn)榄h(huán)境中有諸如Fe3+之類的污染存在而引起,建議用磷酸代替硫酸,以改善此問(wèn)題。

4.2.2.2 鐵氰化鉀法 堿性環(huán)境下,還原糖和K4[Fe(CN)6]與堿共熱可生成K4[Fe(CN)]6。以次甲基藍(lán)為指示劑,在碘化鉀滴定反應(yīng)體系中,由于次甲基藍(lán)氧化性低于三價(jià)鐵,故當(dāng)體系藍(lán)色褪去為滴定終點(diǎn),明確的終點(diǎn),使得反應(yīng)有很好的準(zhǔn)確度和精密度[3839]。本法同斐林氏法一樣需要避免環(huán)境中氧化劑對(duì)結(jié)果的影響,一般通過(guò)保持體系微沸的方式解決;本法中鐵氰化鉀的氧化還原反應(yīng)為可逆反應(yīng),傅海波[40]等,在體系中加入了適量硫酸鋅以沉淀亞鐵氰化鉀,進(jìn)而減小誤差。

4.3 色譜法

色譜法相對(duì)于滴定法專一性更強(qiáng),相較于比色法測(cè)定更具準(zhǔn)確性,且隨著色譜技術(shù)的不斷發(fā)展,色譜法成為分離、分析多糖的主流方法。因?yàn)榇郎y(cè)混合物中各組分有著不同的物理性質(zhì),導(dǎo)致其在固定相與流動(dòng)相間的分配系數(shù)有所差別,當(dāng)待測(cè)物經(jīng)過(guò)層析柱時(shí),樣品在兩相間反復(fù)進(jìn)行分配,在吸附與解析的過(guò)程中產(chǎn)生速度差異,在流過(guò)一定的柱長(zhǎng)后相互分離,最后進(jìn)入檢測(cè)器中。各個(gè)組分所產(chǎn)生的離子流訊號(hào)經(jīng)過(guò)放大,在記錄器上顯示出其相應(yīng)的色譜峰,從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分析的目的[41]。

4.3.1 糖類樣品的預(yù)處理 將多糖裂解成小分子單糖,是進(jìn)行色譜法分析的前提,現(xiàn)常使用酸解法、甲基化處理、smith降解、β消除(O糖苷鍵的稀堿水解)等方法對(duì)樣品進(jìn)行降解。降解所得到的單糖通常不能直接用于色譜分析,需要先根據(jù)色譜性質(zhì)、檢測(cè)要求等進(jìn)行衍生,再進(jìn)行檢測(cè)。

運(yùn)用GC時(shí)需要把單糖衍生成易揮發(fā)且熱穩(wěn)定性良好的物質(zhì)才能進(jìn)行,但由于糖類物質(zhì)通常含有羥基、巰基等極性基團(tuán),其內(nèi)氫鍵作用使得糖類本身并沒(méi)有足夠的揮發(fā)性,所以樣品在氣相色譜分析前必須進(jìn)行預(yù)處理。氣相色譜分析中常見(jiàn)的糖類衍生物有兩類:一類是在吡啶或DMSO中與六甲基二硅烷、三甲基氯硅烷等試劑反應(yīng)生成的三甲基硅醚衍生物。另一類是三氟醋酸鹽多羥基醇衍生物等醋酸衍生物,其中白娣斯[42]通過(guò)對(duì)多種標(biāo)準(zhǔn)單糖的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)糖腈衍生法可以得到與多糖對(duì)應(yīng)的單一的色譜峰且定量精確,是研究食品多糖較為合適的方法。

近年來(lái),GC樣品前處理越發(fā)被人們重視,諸如吹掃捕集(P&T)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)以及微波、超聲等輔助萃取技術(shù)得以發(fā)展[43]。其中,SPME集采集、萃取、富集和上樣于一身,且操作簡(jiǎn)單、無(wú)需溶劑、功能多樣、方便快捷,因而被廣泛應(yīng)用于分析等領(lǐng)域。SPME將固定相涂抹于石英玻璃纖維上作為介質(zhì),對(duì)樣品進(jìn)行萃取和濃縮,并在GC進(jìn)樣口中直接熱解吸(在HPLC中直接以流動(dòng)相沖洗進(jìn)入液相色譜柱)完成上樣。固定相決定著SPME對(duì)樣品的選擇性,相應(yīng)的隨著溶膠凝膠(solgel)技術(shù)、離子液體、分子印跡技術(shù)(MIPs)等技術(shù)的發(fā)展,SPME技術(shù)的熱穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度都有著非常大的提升[44]。SPME-GC/MS多用于對(duì)樣品揮發(fā)物的成分檢測(cè),紀(jì)亞楠[45]等人,分別運(yùn)用蒽酮硫酸法和SPMEGC/MS對(duì)夏黑葡萄果粒進(jìn)行分析,測(cè)得其總糖含量為15.33%±2.19%,以及其揮發(fā)性物質(zhì)的主要16種物質(zhì)類型。

在HPLC中,樣品糖的衍生物較樣品本身?yè)碛懈玫仂`敏度、準(zhǔn)確性,但衍生方法的選擇取決于檢測(cè)器的類型。綜上所述,在分析前需要對(duì)樣品進(jìn)行一定的預(yù)處理即衍生反應(yīng)。常見(jiàn)的衍生方法有:三甲基硅烷化,糖醇乙酸酯衍生化,紫外、熒光標(biāo)記等[46]。

4.3.2 氣相色譜(GC)

4.3.2.1 氣相色譜(GC) GC以氣體為流動(dòng)相,通過(guò)沖洗法進(jìn)行沖刷的分離技術(shù)。通常根據(jù)固定相的選取而分類,其中選取固體的稱為“氣固色譜”,選取液體的稱為“氣液色譜”。其中固定相的極性分布很廣,可依據(jù)待測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行選擇。近幾年來(lái)GC的固定相如:室溫離子液體、金屬有機(jī)框架和碳納米材料的研究都有所突破,為氣相色譜注入新的動(dòng)力[47]。

氣相色譜儀通常有以下系統(tǒng)結(jié)構(gòu):載氣系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、層析柱、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)。載氣(多為惰性氣體或永久性氣體)由高壓鋼瓶經(jīng)減壓閥調(diào)節(jié)流出,通過(guò)進(jìn)樣裝置將待測(cè)樣品帶入層析柱進(jìn)行分離,傳統(tǒng)層析柱一般有填充柱和毛細(xì)管柱兩種。近年來(lái),得益于微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)的發(fā)展,色譜柱實(shí)現(xiàn)微型化,進(jìn)而獲得更快的分析速度和更優(yōu)異的分析性能[48],在糖類物質(zhì)分析中較為常用的層析柱有:OV1701、XE60、XF1150、DB5 等。分離得到的不同組分經(jīng)過(guò)依據(jù)混合氣體物化性質(zhì)所選擇的檢測(cè)器進(jìn)行分析、記錄[49]。目前最為常用的是氫火焰離子化檢測(cè)器(FID),是典型的質(zhì)量型檢測(cè)器,其原理是使用氫火焰電離樣品,進(jìn)而產(chǎn)生微電流用于檢測(cè)。FID普適性強(qiáng),靈敏度高,操作方便,分析結(jié)果穩(wěn)定,常用于定量分析。此外,光度檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器等也可用于糖類分析[50]。

4.3.2.2 裂解氣相色譜(PGC) 利用一定形式的能源熱裂解高聚物,將裂解后的產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)(必要時(shí)輔助以紅外光譜、質(zhì)譜等儀器可增加分析的有效性和高速性),得到特征的裂解色譜圖,可以間接地分析高聚物。在PGC應(yīng)用中,常選用石英毛細(xì)管色譜柱以及FID、MS等靈敏度、選擇性較好的檢測(cè)器組成色譜系統(tǒng)。PGC以其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn),成為分析難揮發(fā)物質(zhì)(如高聚物)的常用方法[51]。劉珊等[52]使用PGC/MS模擬香煙燃燒,測(cè)得龍須菜多糖的熱裂解產(chǎn)物主要是呋喃類、酮類和有機(jī)酸類化合物。

4.3.2.3 氣相色譜串聯(lián)其他檢測(cè)器 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS):匯總了GC高效的分離能力和MS特意的鑒別能力。但由于一級(jí)質(zhì)譜的靈敏度較低,所以在應(yīng)用時(shí)通常將二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)當(dāng)做一級(jí)質(zhì)譜使用[53]。GCMS/MS具有靈敏、快速、鑒別能力強(qiáng)等特點(diǎn),常用于對(duì)混合物中未知組分的定性、定量分析和分子量、分子結(jié)構(gòu)測(cè)定。

氣相色譜紅外光譜聯(lián)用(GCIR):有時(shí)僅MS自檢索結(jié)果很難確定樣品結(jié)構(gòu),而紅外光譜具有快速、非破壞性、多種成分同時(shí)分析等特點(diǎn)可以分析樣品結(jié)構(gòu),但I(xiàn)R只能分析純的化合物,同時(shí),GC擁有高效的分離能力,故將GCIR聯(lián)用,使之成為高效測(cè)定混合物結(jié)構(gòu)的分析手段[54]。

4.3.3 高效液相色譜(HPLC) 當(dāng)樣品對(duì)熱不穩(wěn)定、恢復(fù)性較差時(shí),常使用液相色譜進(jìn)行分析。HPLC根據(jù)分離機(jī)制可分為:分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜和凝膠色譜四種基礎(chǔ)類型。HPLC是最常用的糖類分析方法之一。常用的固體色譜柱有:糖類專用色譜柱和氨基鍵合色譜柱,前者靈敏度高分離效果好,但通常價(jià)格較為昂貴,故后者更為常用。流動(dòng)相常為緩沖液乙晴/甲醇的二元溶液。依據(jù)檢測(cè)器不同可分為以下幾類:

4.3.3.1 高效液相色譜示差折光法(HPLCRID) 示差折光法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T222212008和GB/T222222008中檢測(cè)單糖的方法,該方法可通過(guò)色譜柱流出物光折射率的變化來(lái)連續(xù)測(cè)定樣品濃度,同時(shí)該法不需要衍生,可直接檢測(cè)多糖,操作簡(jiǎn)便且相對(duì)安靜,但其對(duì)環(huán)境溫度及流動(dòng)相流速十分敏感,靈敏度較低、不能進(jìn)行梯度洗脫,使得其無(wú)法同時(shí)對(duì)多種糖分離檢測(cè)[55]。楊婧等[56]使用YMCpack NH3色譜柱,以乙腈水為流動(dòng)相,柱溫25 ℃,RID檢測(cè)器,成功分離并檢測(cè)了刺糖中蔗果三糖的含量。

4.3.3.2 高效液相色譜熒光/紫外光法(HPLC-FLD/UV) 使用熒光檢測(cè)器/紫外檢測(cè)器,本法因其靈敏度高、穩(wěn)定性佳而廣泛應(yīng)用于HPLC,但該方法需要待測(cè)樣品具有熒光或紫外光特性,所以需要對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行衍生處理,同時(shí),本法還要求流動(dòng)相不能在相應(yīng)波長(zhǎng)有所激發(fā)/吸收,使得其在可測(cè)定樣品范圍和流動(dòng)相選擇上大打折扣。

4.3.3.3 高效液相色譜蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD) 蒸發(fā)光散射法使用的是質(zhì)量檢測(cè)器,通過(guò)不揮發(fā)物質(zhì)的顆粒對(duì)光的散射程度與其質(zhì)量成正比的原理,可以對(duì)有質(zhì)量、難揮發(fā)的物質(zhì)進(jìn)行分析,不論其是否具有發(fā)光基團(tuán),同時(shí)該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好,可以進(jìn)行梯度洗脫,在一定程度上彌補(bǔ)了其它高效液相色譜檢測(cè)器的不足。但由于要使流動(dòng)相蒸發(fā)成為氣溶膠,所以回收率較低,對(duì)于高價(jià)值或者易揮發(fā)的樣品有一定的局限性[57]。林慧等[58]使用Grace Previl Carbohydrate ES色譜柱,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,以乙腈水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,同時(shí)測(cè)定了蔗糖、果糖、木糖醇等十種糖和糖醇的含量。

4.3.4 高效陰離子交換色譜脈沖安培檢測(cè)(HPAECPAD) 離子交換色譜本質(zhì)上是HPLC的一種,是利用被分離物質(zhì)在離子交換劑上的交換勢(shì)不同而進(jìn)行分離的方法。常用于分離離子化合物、有機(jī)酸、堿等能電離或可與離子基團(tuán)相互作用的物質(zhì)。常見(jiàn)的離子交換劑有合成樹(shù)脂、纖維素和硅膠三大類,其中合成樹(shù)脂在糖類分析中最為常用。安培檢測(cè)是在一定施加電位下,對(duì)具有電化學(xué)活性的待測(cè)樣品發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的電流變化的測(cè)定。當(dāng)洗脫液進(jìn)入檢測(cè)器后,可以通過(guò)外標(biāo)峰高和峰的保留時(shí)間進(jìn)行分析。而糖類物質(zhì)在恒電位檢測(cè)時(shí)會(huì)在電極上積累并改變其性質(zhì),干擾檢測(cè)結(jié)果,脈沖安培檢測(cè)器通常為三電勢(shì),分別應(yīng)用于檢測(cè)、洗脫和再活化,克服了此問(wèn)題。

糖類是多羥基醛或酮,常見(jiàn)的糖類都是偏酸性的,所以當(dāng)pH≥12時(shí),能夠以陰離子狀態(tài)存在。采用陰離子交換層析柱,以強(qiáng)堿性溶液作為流動(dòng)相,攜帶著陰離子狀態(tài)的糖類物質(zhì),經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂,糖類陰離子吸附于交換樹(shù)脂上,因糖類結(jié)構(gòu)中有疏水基團(tuán),所以吸附力大小取決于糖類物質(zhì)的負(fù)電荷、分子結(jié)構(gòu)及大小。由于吸附力有所差異,因而可用強(qiáng)堿液進(jìn)行梯度洗脫,進(jìn)而分離樣品進(jìn)行分析。本法不需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生,預(yù)處理簡(jiǎn)單,有著靈敏、柱效高、檢測(cè)數(shù)量級(jí)跨度大等優(yōu)勢(shì),是分析糖含量及其組成成分的常用方法[5961]。徐穎等[62]運(yùn)用此法檢測(cè)生物轉(zhuǎn)化物(麥芽糖和海藻糖合酶轉(zhuǎn)化)中海藻糖、麥芽糖和葡萄糖的含量,3種糖含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.93%～2.69%間,重現(xiàn)性良好。

4.3.5 凝膠滲透色譜(GPC) 凝膠滲透色譜又稱為分子篩色譜、體積排除色譜,通過(guò)分子篩效應(yīng)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分:凝膠顆?？讖捷^小,直徑較大的分子不易進(jìn)入,所以洗脫時(shí)沿凝膠顆粒間隙流出,流速快,較先流出色譜柱;而小分子物質(zhì)可以進(jìn)入凝膠相,在洗脫時(shí)需反復(fù)地在凝膠顆粒間進(jìn)入和擴(kuò)散后才能流出色譜柱,洗脫速度較大分子物質(zhì)慢,故分子量小的后流出,以達(dá)到分離目的。同時(shí),用相應(yīng)的多糖做標(biāo)準(zhǔn)品,也可以對(duì)樣品進(jìn)行定量測(cè)定[63]。

4.3.6 毛細(xì)管電泳法(CE) 毛細(xì)管電泳法是利用帶電離子在高壓直流電場(chǎng)中遷移速率不同而分離的分析方法。單糖在強(qiáng)堿性溶液中現(xiàn)負(fù)電荷,硼砂作為緩沖液,可以使糖在較低的pH條件下帶電荷進(jìn)而在復(fù)合電場(chǎng)中完成分離。常用的檢測(cè)方法有UV或LIF檢測(cè)法、MS、核磁共振檢測(cè)(NMR)等。因糖類大多沒(méi)有發(fā)色基團(tuán),故檢測(cè)前常需衍生處理。毛細(xì)管電泳法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、數(shù)據(jù)可靠,在分析方面應(yīng)用日益廣泛,成為單糖和部分寡糖含量的常用檢測(cè)手段[64]。

4.4 其他方法

紅外光譜法(IR)可以快速、非破壞性、同時(shí)分析多種成分的結(jié)構(gòu)。其原理是利用朗伯比爾定律,通過(guò)多糖的特征吸收譜帶強(qiáng)度來(lái)對(duì)應(yīng)組分含量。崔潔[65]等人通過(guò)此方法分析了通過(guò)兩種不同方法提取的山杏果肉可溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu),二者結(jié)構(gòu)相似均可能含有酚類、芳烴類、胺類、醇類化合物。

核磁共振波譜(NMR)是通過(guò)原子躍遷共振而進(jìn)行檢測(cè)的方法。NMR操作簡(jiǎn)便、樣品用量少、可同步完成復(fù)雜樣品的定性定量分析[66]。騰海艷等[67]將單色云芝多糖(CUP)溶于重水,轉(zhuǎn)入核磁管進(jìn)行13C核磁共振分析,確定了CUP的四種連接方式。

酶比色法和酶電極法,是利用酶促反應(yīng)、光化學(xué)特征、離子選擇性和專一性的分離分析方法。該方法有高度專一性,只能同時(shí)測(cè)定單一組分。使用時(shí)應(yīng)注意,受酶的選擇及其反應(yīng)環(huán)境條件對(duì)分析結(jié)果影響較大[68]。以下列舉了不同多糖的提取、分離純化和分析方法見(jiàn)表2。

表2 不同多糖的提取、分離純化和分析方法Table 2 Extraction,purification and identification methods of diffevent polysclccharides

綜上,不同多糖從提取分離到分析的方法都取得了不同程度的發(fā)展,但基于多糖種類和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,針對(duì)不同多糖還需要特定的系統(tǒng)研究方法。不同檢測(cè)環(huán)節(jié)中,單一方法往往有其缺點(diǎn),進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果不理想。所以每個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)該采用一種以上的方法進(jìn)行。這樣才能較好保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然如此,仍然可以總結(jié)出一些共性的方法或特點(diǎn)，如提取分離主要是要去除多糖中的蛋白、脂類和低分子量小分子物質(zhì),所以今后的方法和技術(shù)開(kāi)發(fā)應(yīng)具有特定的針對(duì)性。而分析的難度主要是由于不同多糖是由多種單糖以多種連接方式構(gòu)成。目前來(lái)看,核磁方法相比其他方法在這方面似乎有較好的效果。

5 展望

多糖類物質(zhì)以其重要的生物學(xué)活性和取材廣、毒性小等特點(diǎn),在研究領(lǐng)域,尤其是在制藥行業(yè),將會(huì)扮演極其重要的角色。本文從多糖的提取、分離、分析等環(huán)節(jié)對(duì)其常用方法進(jìn)行論述。

目前,在多糖的提取、分離以及分析前的預(yù)處理環(huán)節(jié)中,更多的是運(yùn)用酸水解等幾種物理、化學(xué)手段的結(jié)合,此種方法對(duì)樣品有一定的損害且得到的產(chǎn)物復(fù)雜尚需進(jìn)一步處理。但隨著生物技術(shù)和酶工程的發(fā)展,在未來(lái),通過(guò)酶的高度特異性和作用條件相對(duì)溫和的特點(diǎn),或許可以直接在樣品中分離且無(wú)損地得到目的產(chǎn)物。

多糖分析方法趨于多樣化,其中色譜法相較于滴定法和比色法有著轉(zhuǎn)移性更強(qiáng),準(zhǔn)確性更佳等優(yōu)點(diǎn)成為多糖類物質(zhì)分析的常用方法。在未來(lái),隨著色譜儀等分析儀器的發(fā)展,多種色譜根據(jù)不同的需求選擇聯(lián)用將成為可能。多糖分析將向著快速、準(zhǔn)確、微量化的方向發(fā)展。

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