郭正洋,劉鐘棟,王遠洋,陳 晶,陳國培,蘭全學(xué),劉小青,*

(1.河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州 450001;2.深圳市計量質(zhì)量檢測研究院,廣東深圳 518131)

銀白色葡萄球菌(Staphylococcusargenteus)作為一種新型葡萄球菌,與金黃色葡萄球菌極其相似[1]。早在2002年在澳大利亞就有相關(guān)報道[2],由于銀白色葡萄球菌缺少合成類胡蘿卜素的基因,在培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈現(xiàn)銀白色,與部分金黃色葡萄球菌的形態(tài)一致[3],通過API生化鑒定系統(tǒng)和vitic2的鑒定方法,也達不到區(qū)分金黃色葡萄球菌和銀白色葡萄球菌的目的[4]。目前有關(guān)銀白色葡萄球菌感染的報道有限,但針對銀白色葡萄球菌的致病性先后在柬埔寨[5]、尼日利亞[6]、法國[7]、斐濟[8]、泰國[9]和多巴哥共和國[10]等國都有相關(guān)描述,在我們國家也有發(fā)現(xiàn)銀白色葡萄球菌的存在[11]。有研究者認為銀白色葡萄球菌與金黃色葡萄球菌會以同樣的方式威脅人體健康[12],在泰國侵襲性葡萄球菌引起的敗血癥,其中五分之一是有銀白色葡萄球菌導(dǎo)致的[1314];在澳大利亞的一項研究中發(fā)現(xiàn),銀白色葡萄球菌會導(dǎo)致皮膚感染和軟骨癥[1]。因此,加強對該菌的認識了解,提高對它的重視,加強對它的監(jiān)測管理已刻不容緩。

Taqman實時熒光PCR技術(shù)從眾多檢測技術(shù)中脫穎而出,它不僅具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點,而且與普通PCR方法相比,由于引物和探針的“雙保險”,因此特異性更強、自動化程度更高,并實現(xiàn)了實時在線檢測,同時適用范圍廣泛,目前已經(jīng)成為一種常用分子生物學(xué)檢測技術(shù)[15]。而非核糖體多肽合成酶基因(NRPS)在金黃色葡萄球菌和銀白色葡萄球菌中都有存在,但在兩種菌種之間該基因一段序列存在明顯差異,這就有利于開發(fā)分子學(xué)方法進行區(qū)別驗證。本文根據(jù)NRPS基因設(shè)計引物探針,建立一種Taqman實時熒光PCR的方法快速檢測銀白色葡萄球菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所需標(biāo)準菌株 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司代為購買(表1);Premix預(yù)混合液RR390A(TAKALA) 由廣州環(huán)凱微生物科技有限公司;引物和探針 均由上海生物工程股份有限公司合成;所用培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;血瓊脂平板 鄭州安圖生物工程股份有限公司。

表1 實驗菌株Table 1 Experimental strains

330K冷凍離心機 Sigma公司;ND1000分光光度計 Gene Company Limited;實時熒光PCR儀MX3005P 美國安捷倫公司;金屬干浴器D1100 Labnet International公司;凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀 BioRad公司;恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物及探針 根據(jù)NCBI上已經(jīng)公布的銀白色葡萄球菌的非核糖體多肽合成酶基因,選擇特異性序列設(shè)計引物和探針。探針5′末端用FAM修飾,3′末端利用猝滅基團C3spacer標(biāo)記,并由上海生物工程有限公司合成其序列見表2。

表2 銀白色葡萄球菌NRPS基因引物及Taqman探針序列Table 2 The primers and probe of Staphylococcus argenteus NRPS

1.2.2 細菌基因組DNA的提取 將本研究中所用的菌株分別接種到營養(yǎng)肉湯中,放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,振蕩時的溫度為35 ℃,振幅160 RPM,過夜培養(yǎng),吸取1 mL培養(yǎng)菌液滴加到1.5 mL離心管內(nèi),在4 ℃條件下12000 r/min離心2 min,棄去上清液,加入500 μL無菌生理鹽水,充分振蕩混勻,在4 ℃條件下12000 r/min離心1 min,棄上清,重復(fù)添加無菌生理鹽水,再離心,棄上清。添加50 μL生理鹽水,100 ℃水浴10～15 min,待冷卻至室溫,之后在4 ℃條件下12000 r/min離心1 min,上清液于20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實時熒光PCR檢測方法的建立 根據(jù) Premix Ex Taq TM(Probe q PCR)Kit試劑盒推薦的各組分濃度和循環(huán)參數(shù),初步建立Taqman探針實時熒光PCR反應(yīng)體系,其中Premix taq(Ex Taq Version 2.0)12.5 μL,上游引物和下游引物各1 μL,探針為0.5 μL,去離子水為8 μL,最后添加2 μL待測模板。并根據(jù)引物、探針的退火溫度,調(diào)整優(yōu)化退火溫度,根據(jù)Ct值確定較為合適的退火溫度。

1.2.4 實時熒光PCR特異性實驗 以銀白色葡萄球菌(DAM 28299)作為陽性對照,無菌生理鹽水作為空白對照,分別對金黃色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,白色葡萄球菌,木糖葡萄球菌,假中間葡萄球菌,頭狀葡萄球菌,山羊葡萄球菌,以及單核細胞增生李斯特菌,阪岐腸桿菌,志賀氏菌,沙門氏菌,副溶血性弧菌,大腸O157等進行檢測。

1.2.5 實時熒光PCR靈敏度實驗 將水煮法提取的編號為DSM 28299的銀白色葡萄球菌的DNA模板,等梯度稀釋至10-5,6個梯度,其DNA模板的濃度為111.7、11.2、1.1、0.1 ng/μL、10、1 pg/μL,無菌生理鹽水作為空白對照,對該方法的靈敏度進行分析。

1.2.6 實驗室分離菌株的鑒定 利用建立的實時熒光PCR方法檢測實驗室通過傳統(tǒng)分離方法得到的金黃色葡萄球菌,其中以DSM 28299的銀白色葡萄球菌為陽性對照,無菌生理鹽水為空白對照。

1.2.7 普通PCR檢測方法的驗證實驗 利用Daofeng Zhang等[12]建立普通PCR方法,對銀白色葡萄球菌的標(biāo)準菌株,以及本方法從實驗室分離株中確定為銀白色葡萄球菌的菌株進行鑒定驗證,序列如表3所示。

表3 常規(guī)PCR鑒定銀白色葡萄球菌的引物Table 3 Conventional PCR primers for the identification of Staphylococcus argenteus

1.2.8 人工模擬污染實驗 取25 g經(jīng)傳統(tǒng)檢測方法未檢出銀白色葡萄球菌的新鮮奧爾良雞肉樣品,加入225 mL 7.5%的生理鹽水,制成勻漿;從上述勻漿中吸取0.5 mL于裝有的營養(yǎng)肉湯的試管中,并再加入0.5 mL濃度為5×108cfu/mL DSM28299 的銀白色葡萄球菌,充分混勻;放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,振蕩時的溫度為35 ℃,振幅160 r/min,過夜培養(yǎng),參照1.2.2中提取DNA的方法,將提取的DNA等梯度稀釋至10-5,6個梯度,其DNA模板的濃度為101.4、10.2、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL,然后進行模擬污染的靈敏度實驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光PCR檢測方法的建立

根據(jù)引物及探針的退火溫度,在擴增時設(shè)計不同的退火溫度,提高該方法的特異性。本實驗以編號為DSM 28299的銀白色葡萄球菌為陽性對照,去離子水作為空白對照,通過在不同退火溫度條件下(55、58、60 ℃)進行擴增,熒光PCR的循環(huán)條件為預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性94 ℃ 5 s,退火延伸55 ℃/58 ℃/60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。結(jié)果如圖1(退火溫度為58 ℃)所示,無論從擴增效率還是Ct值來分析,當(dāng)退火溫度為58 ℃時更符合我們的要求。

圖1 銀白色葡萄球菌實時熒光PCR方法的建立Fig.1 The establishment of a realtime PCR method for Staphylococcus argenteus注:1表示編號為DSM 28299銀白色葡萄球菌的擴增曲線;2表示空白對照的擴增結(jié)果。

2.2 實時熒光PCR特異性分析

1.2.4中各種菌的擴增結(jié)果如圖2和圖3所示,本實驗所建立的實時熒光PCR方法可以檢測出編號為DSM 28299和SITUF 20420的銀白色葡萄球菌,同屬不同種以及常見的致病菌的擴增曲線與空白的擴增曲線呈陰性,從而說明我們所建立的PCR方法的特異性良好,能夠有效的將銀白色葡萄球菌從其他菌中區(qū)分鑒定出來。

圖2 實時熒光PCR方法的特異性實驗1Fig.2 Detection specificity 1 of Staphylococcus argenteus by RTPCR注:1為DSM28299銀白色葡萄球菌;2為SITUF銀白色葡萄球菌;3～8為陰性對照,分別為單增李斯特菌、阪岐腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌;9為空白對照。

圖3 實時熒光PCR方法的特異性實驗2Fig.3 Detection specificity 2 of Staphylococcus argenteus by RTPCR注:1為DSM28299銀白色葡萄球菌;2為SITUF銀白色葡萄球菌;3～9為陰性對照,分別為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、假中間葡萄球菌、山羊葡萄球菌、木糖葡萄球菌;10為空白對照。

2.3 實時熒光PCR靈敏度分析

利用建立的實時熒光PCR方法分別對不同梯度的模板進行檢測(見圖4),結(jié)果表明,當(dāng)DNA模板濃度為0.01 ng/μL,結(jié)果呈現(xiàn)規(guī)則的,典型的擴增曲線;而當(dāng)模板濃度為0.001 ng/μL時,也就是1 pg/μL,雖然擴增曲線與空白之間存在差異,但其Ct值偏大,影響結(jié)果的判定。從而說明本實驗實時熒光PCR方法檢測銀白色葡萄球菌的靈敏度為0.01 ng/μL。

圖4 實時熒光PCR方法的靈敏度實驗Fig.4 Detection sensitivity of Staphylococcus argenteus by RTPCR注:1～7分別代表DNA模板的濃度為111.7、11.2、1.1、0.1、0.01、0.001 ng/μL以及空白對照的擴增結(jié)果。

2.4 分離菌株的檢測

采用建立的熒光PCR方法對實驗室通過傳統(tǒng)分離得到的SA 2016026、SA 21016027、SA 2016028、SA 2016029、SA 2016030、SA 2016031、SA 2016040、SA 2016041、SA 2016047、SA 2016048、SA 2017001、SA 2016002等12株金黃色葡萄球菌鑒定分析。實驗結(jié)果如圖5所示,并由此看出SA 2016030、SA 2016047的擴增曲線呈陽性。

圖5 實時熒光PCR方法對分離菌株的鑒定實驗Fig.5 Identification test of isolated strains by RTPCR注:1代表菌株SJTUF 20420;2代表實驗室分離菌株SA 2016030;3代表DSM28299;4代表實驗室分離菌株SA 2016047;曲線5～14分別為實驗室分離的金黃色葡萄球菌SA 2016026、SA 21016027、SA 2016028、SA 2016029、SA 2016031、SA 2016040、SA 2016041、SA 2016048、SA 2017001、SA 2016002;曲線15為空白對照。

2.5 普通PCR檢測方法的驗證實驗

利用文獻中提到的普通PCR檢測方法[12],對金黃色葡萄球菌的標(biāo)準菌株,銀白色葡萄球菌的標(biāo)準菌株以及本實驗鑒定得到的銀白色葡萄球菌(SA 2016030、SA 2016047)進行檢測,其中金黃色葡萄球菌的擴增產(chǎn)物的長度136 bp,而銀白色葡萄球菌的擴增長度為316 bp。擴增結(jié)果如圖6所示,銀白色葡萄球菌SJTUF 20420、DSM 28299、分離菌株SA 2016030和SA 2016047的擴增產(chǎn)物的長度為316 bp,而金黃色葡萄球菌ATCC 27217、ATCC 25923、CMCC 26003、GIM 1.481的擴增產(chǎn)物的長度為136 bp。所以,實驗室分離菌株SA 2016030、SA2016047為銀白色葡萄球菌。

圖6 普通PCR擴增結(jié)果Fig.6 PCR amplicons of the nonribosomal peptide synthetase gene from different strains注:M代表Maker;1代表SJTUF 20420;2代表DSM 28299;3代表SA 2016030;4代表SA 2016047;5代表ATCC 25923;6代表為ATCC 27217;7代表為CMCC 26003;8代表GIM 1.481;NC為空白對照。

通過利用普通PCR檢測方法的驗證,進一步的證明本文所建立的方法具有極強的準確性。雖然文獻中的PCR方法相比于傳統(tǒng)的多位點序列分型(MLST)的鑒定方法,節(jié)約時間,但其不足之處是在結(jié)果判定的過程中,容易引起污染,影響結(jié)果的判讀。而本文所建立的方法相對文獻中方法更快,并能通過熒光實時觀察。

2.6 模擬污染實驗

將DSM28299銀白色葡萄球菌接種于含有新鮮奧爾良雞肉的營養(yǎng)肉湯中,過夜培養(yǎng),之后提取DNA模板,等梯度稀釋,分別對不同梯度的模板進行檢測結(jié)果見圖7。結(jié)果表明,當(dāng)DNA模板濃度為0.01 ng/μL,結(jié)果呈現(xiàn)規(guī)則的,典型的擴增曲線;而當(dāng)模板濃度為0.001 ng/μL時,也就是1 pg/μL,雖然擴增曲線與空白之間存在差異,但其Ct值偏大,與空白的差異不明顯,影響結(jié)果的判定。從而說明本實驗實時熒光PCR方法對污染樣品中銀白色葡萄球菌的靈敏度為0.01 ng/μL。

圖7 污染食品中銀白色葡萄球菌實時熒光PCR方法的靈敏度實驗Fig.7 Sensitivity of RTPCR method for Staphylococcus argenteus in contaminated foods注:1～7分別代表DNA模板的濃度為101.4、10.2、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL以及空白對照的擴增結(jié)果。

3 結(jié)論

本研究利用銀白色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌在NRPS基因上的差異設(shè)計引物及探針,通過引物對的篩選及反應(yīng)體系的優(yōu)化,建立銀白色葡萄球菌的Taqman實時熒光PCR檢測方法,并利用建立的方法在對實驗室通過傳統(tǒng)生化鑒定得到的金黃色葡萄球菌分離菌株的鑒定,發(fā)現(xiàn)在12株原本鑒定為金黃色葡萄球菌中,存在2株銀白色葡萄球菌,且其檢出率相當(dāng)于金黃色葡萄球菌的1/6,進一步證實銀白色葡萄球菌在我國的存在,為銀白色葡萄球菌的開發(fā)利用提供基礎(chǔ);在特異性實驗中,可以檢測到銀白色葡萄球菌,葡萄球菌屬中同屬不同種以及其他不同屬的常見致病菌的擴增結(jié)果全部呈陰性,且本方法對銀白色葡萄球菌的檢測靈敏度可以達到為10 pg/μL,整個檢測過程只需60 min,可以短時間獲得檢測結(jié)果。

綜上所述,本實驗建立的Taqman實時熒光PCR方法特異性強,靈敏度高,檢測時間短,操作簡便,并且對樣品中分離菌株也能夠有效的區(qū)分,在實際檢測中具有很強的適用性,為銀白色葡萄球菌快速精準的檢測提供可靠的技術(shù)手段,適合在檢驗檢疫系統(tǒng)內(nèi)、食品安全監(jiān)管及食品加工等部門推廣應(yīng)用。

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