方 坤,李堅(jiān)斌,2,*,魏群舒,聶 卉,劉培華,陳 雨,江寧寧

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;2.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西南寧 530004)

魔芋葡甘露聚糖(koniac glucomannan,簡(jiǎn)稱KGM)是由D葡萄糖和D甘露糖按1∶1.6的比例以β1,4糖苷鍵聚合的大分子多糖,具有優(yōu)良的成膜特性和膠凝特性[15],已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥,化工等領(lǐng)域[611]。但是,由于葡甘露聚糖分子量大、水溶性差、水溶膠不穩(wěn)定,尤其是在高溫和冷凍條件下穩(wěn)定性極差,使其應(yīng)用受到限制[12]。為了改善其性能,擴(kuò)大應(yīng)用范圍,研究中通常需要對(duì)KGM進(jìn)行改性,如脫乙酰[13]、氧化[14]、酯化[1516]、羧甲基化[17]等。

海藻酸鈉(sodium alginate,簡(jiǎn)稱SA)存在于褐藻類中的一種天然高分子,由D甘露糖醛鏈段和L古洛糖醛鏈段交替結(jié)構(gòu)組成[18]。作為一種天然多糖聚合物,由于其優(yōu)異的性能,如它的生物相容性好,天然降解性好,無(wú)毒性[1920],近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。海藻酸鈉可與許多化合物進(jìn)行共混,已見有將海藻酸鈉與聚乙烯醇[21]、纖維素[22]、羧甲基殼聚糖[23]、羧甲基淀粉[24]、聚乳酸[25]、硫酸軟骨素[26]等共混制膜的報(bào)道。有研究表明[27],共混后KGM與殼聚糖、海藻酸鈉等之間,相互作用較強(qiáng),相容性良好,共混之后,性能明顯改善。微囊的制備方法有很多,如物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)結(jié)合法等。Gula等[28]用噴霧干燥法,以氨磷汀為模型藥物,制備腸溶微囊,具有較高的生物降解性。徐傳芳等[29]采用原位聚合法,將脲醛樹脂作為囊材,以茉莉香精為芯材,制得流動(dòng)性好的粉末狀香精微膠囊。廖志平[30]用溶劑非溶劑法制備了維生素C微囊緩釋片,使用乙基纖維素作為囊材,二甲苯和乙醇作為溶劑,正己烷作為非溶劑,沉淀出乙基纖維素,包裹維生素C,形成微囊。微囊常用的制備方法對(duì)于不同的芯材性質(zhì),制備工藝條件,以及囊材的選擇上都有各自的局限性。而銳孔法[31]是利用聚合物的快速固化作用,先將芯材和壁材溶解成溶液,再通過銳孔成形,滴入固化溶液中,聚合物便產(chǎn)生沉淀凝結(jié),形成囊壁,包裹芯材,其工藝簡(jiǎn)單易操作。

本研究首先通過二步加堿法[32]將魔芋葡甘露聚糖進(jìn)行改性,制備出羧甲基魔芋葡甘露聚糖(carboxymethyl konjac glucomannan,簡(jiǎn)稱CMKGM),然后將改性后的魔芋葡甘露聚糖與海藻酸鈉共混,采用銳孔法制備微囊,探究其成膜的工藝條件并對(duì)其包封率和載藥率進(jìn)行初步研究,為魔芋葡甘露聚糖與海藻酸鈉緩釋微囊在食品、醫(yī)藥、化工、材料等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魔芋葡甘露聚糖 北海多環(huán)保健品有限公司;海藻酸鈉 成都市科龍化工試劑廠;牛血清白蛋白(BSA)、CaCl2國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 皆為分析純。

DVⅡ+Pro粘度計(jì) 美國(guó)Brookfield公司;電動(dòng)厚度測(cè)定儀 四川省長(zhǎng)江造紙儀器廠;D402F電動(dòng)攪拌機(jī)、YQZ7擺錘式紙張抗張力實(shí)驗(yàn)機(jī) 四川省長(zhǎng)江造紙儀器廠;TA.XT.Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro System公司;JY92IIN超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CMKGM及CMKGM/SA膜的制備 參照張瑜等人[32]的二步加堿法,稱取5.0 g KGM置于500 mL三口燒瓶的濃度為70%乙醇溶液中,加入1.0 mol/L的NaOH溶液,使pH為11,堿化2 h。堿化處理后,加入0、1.25、2.5、3.75、5、10 g氯乙酸,進(jìn)行醚化處理3 h,控制醚化溫度為50.0 ℃。用1.0 mol/L的鹽酸溶液,調(diào)節(jié)pH至7.0,減壓抽濾,用60%(v/v)、80%(v/v)和無(wú)水乙醇溶液洗滌濾餅數(shù)次,40.0 ℃下真空干燥,得到白色粉末產(chǎn)物,即CMKGM,并根據(jù)氯乙酸與KGM質(zhì)量比分別編號(hào)為KGM(0∶1)、CMKGM1(0.25∶1)、CMKGM2(0.5∶1)、CMKGM3(1∶1)、CMKGM4(1.5∶1)、CMKGM5(2∶1)。稱取5.0 g CMKGM溶解于去離子水中,按照CMKGM∶SA為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1比例添加海藻酸鈉,放置在50.0 ℃水浴鍋中,攪拌,涂布于干凈的玻璃板上,置于60.0 ℃干燥箱中干燥3 h,冷卻,揭膜,得到CMKGM/SA膜。

1.2.2 取代度的測(cè)定 酸化滴定法是羧甲基取改性產(chǎn)物取代度測(cè)定的常用方法[33]。稱取CMKGM 1.0 g,溶于40.0 mL的2.0 mol/L鹽酸溶液,磁力攪拌,過濾,用無(wú)水乙醇洗滌樣品,直至濾液用硝酸銀檢測(cè)無(wú)氯離子為止。量取0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液40.0 mL,溶解CMKGM,微熱,即用0.1 mol/L的HCl溶液滴定NaOH,用酚酞作指示劑,記錄消耗的HCl溶液體積。

A=(CNaOH×VNaOHCHCl×VHCl)/m

式(1)

DS=A×0.162/(10.058A)

式(2)

式中:A1.0 g樣品所消耗的NaOH的量,mmol;m稱樣量,g;DS取代度;0.162KGM的失水葡萄糖(或甘露糖)單元的毫摩爾質(zhì)量,g/mmol;0.058失水葡萄糖(或甘露糖)單元的一個(gè)羥基被羧甲基取代后單元毫摩爾質(zhì)量的凈增量,g/mmol。

1.2.3 取代度對(duì)膜拉伸性能的影響 由1.2.1的制備方法,得出不同取代度的CMKGM,研究不同取代度對(duì)膜拉伸性能的影響。

1.2.4 CMKGM與SA的質(zhì)量比對(duì)膜拉伸性能的影響 選取CMKGM1、CMKGM3和CMKGM5,研究其與海藻酸鈉在mCMKGM1∶mSA為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1條件下對(duì)CMKGM/SA膜拉伸性能的影響。

1.2.5 溫度對(duì)膜拉伸性能的影響 選取CMKGM1、CMKGM3和CMKGM5,在CMKGM∶SA為3∶1,在溫度為40.0、50.0、60.0、70.0、80.0 ℃,測(cè)定其抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率,研究溫度對(duì)CMKGM/SA膜拉伸性能的影響。

1.2.6 pH對(duì)膜拉伸性能的影響 選取CMKGM1、CMKGM3和CMKGM5,在CMKGM∶SA為3∶1,溫度為50.0 ℃,在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時(shí),測(cè)定其抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率,研究pH對(duì)CMKGM/SA膜拉伸性能的影響。

1.2.7 膜力學(xué)性能的測(cè)定 參照GB/T1040.32006測(cè)量膜力學(xué)性能,使用擺錘式紙張抗張力儀測(cè)定其抗拉強(qiáng)度和延伸度,夾距10 cm,拉伸載荷為250 N,實(shí)驗(yàn)速度為(100±10) mm/min,每個(gè)膜測(cè)定3個(gè)樣取平均值。

抗拉強(qiáng)度以U(MPa)表示,計(jì)算公式如下:

式(3)

式中:P最大負(fù)荷(N);b試樣寬度(mm);d試樣厚度(mm)。

伸長(zhǎng)率以E(%)表示,按下式計(jì)算:

式(4)

式中:L0試樣原始標(biāo)線間距離(mm);L試樣斷裂時(shí)距離標(biāo)線間距離(mm)。

1.2.8 微囊的制備 稱取3.0 g CMKGM溶于去離子水中,攪拌,加入1.0 g的海藻酸鈉,繼續(xù)攪拌至混勻,再分別稱取10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg牛血清蛋白(BSA),加入并攪拌均勻,用1 mL注射器以30 r/min的速度滴入CaCl2溶液中,固化,去離子水沖洗,真空干燥。

1.2.9 微囊載藥率和包封率測(cè)定

1.2.9.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取0.2500 g BSA,用去離子水溶于250 mL容量瓶中,得到1 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別移取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液定溶于50 mL容量瓶中,得到40、80、120、160、200、240 μg/mL的溶液。在最大吸收波長(zhǎng)279 nm[34]處,以去離子水作參比液的條件下進(jìn)行測(cè)定,將結(jié)果作BSA濃度與吸光度的曲線,并用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:C=1548.5A+0.6372,R2=0.9998;其中C為濃度,A為吸光度。

1.2.9.2 樣品測(cè)定 精確稱取15 mg的微囊,研碎,分散于100 mL的磷酸緩沖液中,充分溶解。精密量取l.0 mL濾液,置于50 mL容量瓶中,加釋放液至刻度,搖勻。以空白磷酸釋放液為對(duì)照,在波長(zhǎng)279 nm處測(cè)定濾液吸光度A,根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物含量,計(jì)算得出載藥率、包封率。載藥率、包封率由下式求得:

式(5)

式(6)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Origin 8.5軟件來(lái)完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 CMKGM的取代度

由1.2.1的方法制備得到CMKGM,取代度結(jié)果如表1所示。

表1 CMKGM的取代度Table 1 Degree of substitution of CMKGM

由表1可知,隨著氯乙酸與KGM比例的升高,CMKGM的取代度也隨之升高,最高達(dá)到75%。

2.2 CMKGM/SA成膜性能的研究

2.2.1 取代度對(duì)CMKGM拉伸性能的影響 由圖1可知,CMKGM與KGM相比,膜抗拉強(qiáng)度增大,在取代度為75%時(shí)達(dá)到最大,因?yàn)轸燃谆〈鶮GM分子中的羥基,分子間作用力增大,從而制得的膜抗拉強(qiáng)度大。隨著取代度的增加,伸長(zhǎng)率先減小后增大,取代度為27%和40%的CMKGM的伸長(zhǎng)率比原KGM小,取代度為57%、71%和75%的CMKGM的伸長(zhǎng)率比原KGM大。因?yàn)槿〈刃r(shí),分子內(nèi)部基團(tuán)之間相互作用力小,因此伸長(zhǎng)率小。當(dāng)羧甲基數(shù)量增大時(shí),基團(tuán)間的作用力增大,伸長(zhǎng)率增大,這與之前肖蕊等[35]的報(bào)道相一致。

圖1 不同取代度CMKGM膜抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率Fig.1 Tensile strength and extension of films of CMKGM with different DS

2.2.2 CMKGM與SA的質(zhì)量比對(duì)拉伸性能的影響 由圖2可知,CMKGM1、CMKGM3和CMKGM5膜的抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率隨著CMKGM∶SA的增大而先升后降。在CMKGM∶SA為3∶1時(shí),CMKGM與SA的協(xié)同作用最強(qiáng),分子結(jié)構(gòu)緊密,抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率達(dá)到最大。當(dāng)CMKGM∶SA繼續(xù)增大時(shí),由于CMKGM分子數(shù)量增多,SA分子數(shù)量相對(duì)小,分子間結(jié)合不完全,導(dǎo)致抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率下降。

圖2 CMKGM/SA膜抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率Fig.2 Tensile strength and extension of films of CMKGM/SA

2.2.3 溫度對(duì)拉伸性能的影響 由圖3可知,CMKGM1、CMKGM3和CMKGM5膜的抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率隨溫度的增大先升后降。溫度較低時(shí),CMKGM和SA溶脹不完全,分子間結(jié)合不牢固,制備的薄膜抗拉強(qiáng)度小,抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率低,當(dāng)溫度為50.0 ℃時(shí)達(dá)到最大。溫度繼續(xù)升高到80.0 ℃,分子運(yùn)動(dòng)加劇,分子間結(jié)合困難,剛性結(jié)構(gòu)差,抗拉強(qiáng)度下降,水分蒸發(fā)較快,膜含水量過少,質(zhì)地硬脆,伸長(zhǎng)率明顯下降,抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率達(dá)到最小。成膜溫度以50.0 ℃為宜,制備的薄膜抗拉強(qiáng)度較高,伸長(zhǎng)率較大。

圖3 溫度對(duì)膜抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率的影響Fig.3 Effect of temperature on tensile strength and extension of films

2.2.4 pH對(duì)拉伸性能的影響 由圖4可知,CMKGM1、CMKGM3和CMKGM5膜的抗拉強(qiáng)度和隨pH的增大先升后降。當(dāng)pH低時(shí),溶液中的氫離子會(huì)與CMKGM和SA中的羧甲基結(jié)合,影響CMKGM和SA分子間的結(jié)合,膜的抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率均不高；隨著pH的增加，膜的抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率增大,當(dāng)pH為7.0時(shí),達(dá)到最大;當(dāng)pH大于7.0時(shí),CMKGM的溶脹不完全,與SA的協(xié)同作用減弱,膜的抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率降低。

圖4 pH對(duì)膜抗拉強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率的影響Fig.4 Effect of pH on tensile strength and extension of films

2.3 CMKGM/SA微囊制備的研究

由2.2結(jié)果可知,當(dāng)CMKGM和SA復(fù)配后,膜拉伸性能會(huì)有所改變。進(jìn)一步研究其對(duì)微囊包封率和載藥率的影響。

2.3.1 羧甲基葡甘露聚糖與海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)微囊包封率和載藥率的影響 由圖5可知,隨著CMKGM∶SA的增大,微囊包封率和載藥率都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。這可能由海藻酸鈉與Ca2+離子的結(jié)合造成的。每個(gè)海藻酸和衍生物的大分子中都有許多自由的羥基和羧基,能夠與Ca2+等大多數(shù)金屬離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng),形成凝膠。將海藻酸鈉滴入CaCl2溶液中,Ca2+將海藻酸鈉中的Na+和H+置換出來(lái)。隨著Ca2+逐漸滲入凝膠丸內(nèi)部,凝膠丸內(nèi)部逐層發(fā)生膠凝,影響其包封率和載藥率[36]。當(dāng)CMKGM∶SA為3∶1時(shí)，各微囊的包封率和載藥率達(dá)到最大。

圖5 羧甲基葡甘露聚糖與海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)微囊包封率和載藥率的影響Fig.5 Effect of CMKGM∶SA on encapsulation efficiency and drugloading rate of microcapsule

2.3.2 牛血清蛋白的質(zhì)量對(duì)微囊包封率和載藥率的影響 由圖6可知,隨著牛血清蛋白質(zhì)量的增大,微囊包封率和載藥率先增大后減小,當(dāng)牛血清蛋白質(zhì)量為30.0 mg時(shí)達(dá)到最大,包封率分別為72%、75%、74%,載藥率分別為63%、72%、76%。當(dāng)牛血清蛋白質(zhì)量為30.0 mg以上時(shí),由于載體無(wú)法完全包裹住過量的藥物,所以包封率和載藥率降低。

圖6 牛血清蛋白的質(zhì)量對(duì)微囊包封率和載藥率的影響Fig.6 Effect of BSA’s quality on encapsulation efficiency and drugloading rate of microcapsule

3 結(jié)論

將葡甘露聚糖采用羧甲基改性并與海藻酸鈉復(fù)配后,將對(duì)葡甘露聚糖/海藻酸鈉共混膜產(chǎn)生影響,研究發(fā)現(xiàn):在取代度為75%,羧甲基魔芋葡甘露聚糖與海藻酸鈉質(zhì)量比為3∶1,溫度為50.0 ℃,pH為7.0時(shí),羧甲基魔芋葡甘露聚糖/海藻酸鈉共混膜具有較強(qiáng)的拉伸作用。進(jìn)一步利用該共混膜和模型藥物(牛血清蛋白)制備葡甘露聚糖/海藻酸鈉緩釋微囊后發(fā)現(xiàn),當(dāng)牛血清蛋白質(zhì)量為30.0 mg時(shí),微囊包封率和載藥率達(dá)到最大,分別為74%和76%。這種良好的拉伸性能和優(yōu)良的載藥效果,將拓寬羧甲基魔芋葡甘露聚糖/海藻酸鈉緩釋微囊在醫(yī)藥等方面的應(yīng)用。

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