余 敏,黃晶晶,付瑞燕,謝寧寧,*,殷俊峰,鄢 嫣,張福生

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,安徽合肥 230031;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品學(xué)院,安徽合肥 230036)

降糖肽通常指能夠用于治療II型糖尿病的一類活性肽[1],目前主要來源于苦瓜[2]、山杏[3]、人參[4]、海產(chǎn)[5]和乳[67]等。而葡萄糖苷酶抑制劑作為降糖肽的一種[8],能夠競爭性抑制小腸葡萄糖苷酶活性,延緩或抑制葡萄糖吸收,有效降低餐后血糖[9]。豆粕,是大豆經(jīng)過冷榨制油后得到的副產(chǎn)品,蛋白質(zhì)含量約為45%～52%。豆粕蛋白經(jīng)過酶解處理后,才能夠生成具有多種生物功能的活性肽,主要包括抗氧化肽[10]、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽[1112]、金屬螯合肽[13]等。研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),豆粕蛋白酶解產(chǎn)物具有優(yōu)異的α葡萄糖苷酶抑制活性,可作為葡萄糖苷酶抑制劑降糖肽的良好來源。目前降糖肽的生產(chǎn)工藝包括將苦瓜汁稀釋后經(jīng)過超濾分離降糖肽[2]或采用堿溶酸沉法提取山杏蛋白[3]等,生產(chǎn)成本較高,環(huán)境污染較重。同時,豆粕蛋白酶解產(chǎn)物濃度高、溶解性好,且未見豆粕蛋白降糖肽的相關(guān)研究報道。因此,利用蛋白酶解豆粕生產(chǎn)降糖肽前景較好[4]。

本研究以大豆豆粕為原料,采用蛋白提取和酶解技術(shù),運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化堿性蛋白酶(Alcalase)水解大豆豆粕工藝,并進(jìn)行工藝驗(yàn)證,以期為豆粕蛋白的開發(fā)利用提供新的解決策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆豆粕 合肥立新食品科技有限公司(粗蛋白質(zhì)≥46.0%);鹽酸、硫酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、碳酸鈉 分析純,北京化工廠;石油醚 分析純,天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠;α葡萄糖苷酶 液態(tài),酶活≥50 units/mg蛋白質(zhì),上海源葉生物科技有限公司;堿性蛋白酶 液態(tài),酶活0.6 AU/g,丹麥諾和諾德公司;4硝基苯酚βD吡喃葡萄糖苷 PNPG,液態(tài),上海寶曼生物科技有限公司。

JA1103N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;PHS3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TGL16M型離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;FD1CE型冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;HR801型酶標(biāo)分析儀 深圳市華科瑞科技有限公司;ZD85型氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市精達(dá)儀器制造有限公司;HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 大豆豆粕→脫脂→堿提取、酸沉淀→冷凍干燥→大豆蛋白粉→溶解→調(diào)節(jié)pH成堿性→加酶→酶解→滅酶→調(diào)節(jié)pH→離心→取上清液→測定α葡萄糖苷酶的抑制率。

1.2.2 蛋白提取 將大豆豆粕浸泡于石油醚中,多次更換石油醚,直至石油醚層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后無剩余物質(zhì),說明脫脂徹底。抽濾,置于通風(fēng)櫥中室溫干燥12 h,密封保存。

采用堿溶酸沉法[3]提取大豆豆粕分離蛋白。將脫脂大豆豆粕用去離子水溶解,料液比1∶10(w∶v)。待完全溶解后用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.0,靜置60 min,抽濾,收集液體于室溫下以4000 r/min離心15 min,收集上清液。然后用0.2 mol/L HCl溶液將上清液的pH調(diào)至4.0,靜置30 min,再次于室溫下以5000 r/min離心15 min,取其下層沉淀物質(zhì),在干燥器中密封保存。

蛋白提取率(%)=提取的蛋白干重/豆粕中總蛋白干重×100

其中,干重是在恒溫干燥箱中將材料烘干(105 ℃)至恒重,用分析天平稱量獲得。

1.2.3 酶解 稱取適量大豆豆粕蛋白粉,加入適量去離子水溶解配制成具有一定濃度的蛋白溶液。將溫度調(diào)節(jié)至酶解反應(yīng)溫度,用NaOH溶液與HCl溶液將pH調(diào)節(jié)至反應(yīng)所需值,加入一定比例的堿性蛋白酶,放入氣浴恒溫振蕩器中進(jìn)行恒溫酶解,保持反應(yīng)體系pH恒定,達(dá)到預(yù)定反應(yīng)時間后,將酶解液放入沸水浴15 min，使酶鈍化。酶解液在室溫中冷卻后,用NaOH溶液與HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性,于室溫下以4000 r/min離心10 min,所需的豆粕蛋白降血糖粗肽存在于上清液中,將其冷凍保存?zhèn)溆?。采用TNBS法測定蛋白水解度(DH)[14]。

1.2.4 活性測定 在2 mL的離心管中依次加入5 μL 30 U/mL的α葡萄糖苷酶溶液、10 μL的樣品溶液、620 μL 0.1 mol/L pH為6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS),混勻后在37.5 ℃條件下反應(yīng)20 min。然后加入10 μL 10 mmol/L的PNPG溶液,混勻后在37.5 ℃條件下反應(yīng)30 min。最后加入650 μL 0.2 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。用分光光度計(jì)測定每個樣品在410 nm波長下的最大吸光度[15]。α葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式為:

α葡萄糖苷酶抑制率(%)=[A空白(A樣品-A樣品對照)]/A空白×100

其中,A空白、A樣品、A樣品對照分別為空白組、樣品組和樣品對照組對應(yīng)的吸光度值。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 選擇初始pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)、酶解溫度(35、40、45、50、55、60、65 ℃)、酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)、加酶量(1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%)和料液比(1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100、8∶100、9∶100)5個因素作單因素實(shí)驗(yàn),考察各單因素對酶解產(chǎn)物α葡萄糖苷酶抑制活性的影響。將其中一個作為單因素時,其他四個因素的固定實(shí)驗(yàn)水平分別是初始pH9.0、酶解溫度45.0 ℃、酶解時間6 h、加酶量2%(w∶w)和料液比1∶20(w∶v)。

1.2.6 響應(yīng)曲面分析方法 根據(jù)BoxBehnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理,綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇單因素實(shí)驗(yàn)中的顯著因素(初始pH、酶解溫度和酶解時間)進(jìn)行優(yōu)化[16],見表1。

表1 響應(yīng)曲面分析因素及水平表Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示,采用DesignExpert 8.0.5軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)方案并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白提取率

采用堿溶酸沉法提取豆粕分離蛋白,提取率為60.56%,與已有研究結(jié)果相似。李桂菊[16]發(fā)現(xiàn),蛋白提取率達(dá)到最高值66.51%。

2.2 酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 初始pH對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響 圖1顯示,初始pH在8.0～10.0時酶解產(chǎn)物對α葡萄糖苷酶抑制活性較高,初始pH為9.0時達(dá)到最高點(diǎn),為13.5%(p<0.05)。當(dāng)初始pH小于或大于9.0時,酸堿條件會影響酶的活性和底物的構(gòu)象[17]。因此反應(yīng)體系的初始pH應(yīng)控制在9.0左右。

圖1 初始pH對酶解產(chǎn)物活性的影響Fig.1 Effect of initial pH value on enzymatic hydrolysates activity注:不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖5同。

2.2.2 酶解時間對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響 圖2顯示,酶解產(chǎn)物對α葡萄糖苷酶的抑制活性在酶解4 h左右時達(dá)到了最高點(diǎn)與5 h時α葡萄糖苷酶抑制率無顯著差異(p>0.05),但顯著高于其他酶解時間(p<0.05),而在4 h后呈緩慢下降趨勢,這可能是由于酶解底物中包含了可溶性蛋白和不溶性蛋白,可溶性蛋白的敏感性肽鍵會在最初階段快速斷裂,而不敏感肽鍵斷裂緩慢;而不溶性蛋白的酶解過程中,酶吸附在不溶性蛋白的表面,首先水解結(jié)合較稀疏的聚合肽,然后再緩慢水解中心的肽鍵[18]。另外,酶解6 h后具有活性的肽鏈被過度酶解,結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抑制活性大大降低。綜合考慮，反應(yīng)體系的的酶解時間應(yīng)控制在4 h左右。

圖2 酶解時間對酶解產(chǎn)物活性的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on enzymatic hydrolysates activity

2.2.3 溫度對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響 圖3顯示,溫度從40 ℃上升至50 ℃時,酶解產(chǎn)物對α葡萄糖苷酶的抑制活性緩慢增加,在50 ℃時達(dá)到最高(p<0.05)。隨著溫度繼續(xù)升高,蛋白酶的活性受到抑制,酶解的速度降低,酶解產(chǎn)物對α葡萄糖苷酶的抑制活性也會降低,與薛照輝[19]等的研究結(jié)果相似,他發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解鷹嘴豆分離蛋白在50 ℃時水解度達(dá)到最大。因此反應(yīng)體系的的酶解溫度應(yīng)控制在50 ℃左右。

圖3 酶解溫度對酶解產(chǎn)物活性的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysates activity

2.2.4 加酶量對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響 圖4顯示,加酶量小于1.5%時,其變化對酶解產(chǎn)物的α葡萄糖苷酶抑制活性影響很小。當(dāng)加酶量高于1.5%時,由于底物相對較少,酶含量相對較高,所以酶解產(chǎn)物的抑制活性顯著增加(p<0.05)。結(jié)果表明,只要加酶量大于2.0%后,加酶量將不再影響酶解產(chǎn)物對α葡萄糖苷酶的抑制活性。另外,由于酶本身也是蛋白質(zhì),也會發(fā)生酶解,加酶量過高則會干擾酶解產(chǎn)物的組成[2021]。因此,從經(jīng)濟(jì)和效率考慮,加酶量應(yīng)保持在2.0%左右。

圖4 加酶量對酶解產(chǎn)物活性的影響Fig.4 Effect of enzyme amount on enzymatic hydrolysates activity

2.2.5 初始料液比對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響 圖5顯示,當(dāng)初始料液比為5∶100時,酶解產(chǎn)物的抑制活性達(dá)到最高點(diǎn)，顯著高于料液比1∶100和3∶100時的抑制率(p<0.05),而且此后無顯著變化(p>0.05)。這可能是因?yàn)橹参锏鞍字泻兄参锏鞍酌敢种苿?能與蛋白酶作用與底物共享蛋白酶的結(jié)合基團(tuán),表現(xiàn)出競爭性抑制作用[17]。因此反應(yīng)體系的初始料液比應(yīng)控制在5∶100左右。

圖5 初始料液比對酶解產(chǎn)物活性的影響Fig.5 Effect of initial solidliquid ratio on enzymatic hydrolysates activity

可見,初始pH、酶解時間、酶解溫度這三個因素影響顯著(p<0.05),加酶量以及料液比影響不顯著(p>0.05)。因此,在響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)中只對初始pH、酶解時間和酶解溫度這三個因素進(jìn)行優(yōu)化,選擇料液比為5∶100、加酶量為2%作為固定實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解工藝

2.3.1 響應(yīng)曲面分析結(jié)果 根據(jù)DesignExpert 8.0.5軟件設(shè)計(jì)的三因素三水平的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn),進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface methodology

采用DesignExpert 8.0.5軟件程序?qū)σ陨系膶?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,分析結(jié)果得出堿性蛋白酶(Alcalase)酶解大豆豆粕蛋白制備降糖肽的回歸方程為:

Y=335.53975+51.44350A+3.39438B+7.67712C0.039750AB+0.30875AC0.059000BC-2.63200A20.028445B20.76112C2

為了檢驗(yàn)上述方程的有效性,對回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)曲面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

表3表明模型p<0.0001,說明堿性蛋白酶酶解大豆豆粕蛋白制備降糖肽的α葡萄糖苷酶抑制率的回歸方程模型極顯著,同時失擬差p為0.1146>0.05不明顯,進(jìn)一步說明了該模型的合理性。因此可以用此模型對整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。模型的分析參考類似研究[2223],均是從模型p值、失擬差等角度分析模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,判斷回歸方程預(yù)測的準(zhǔn)確性。

三個因素對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響比較復(fù)雜。在上述回歸方程的所有一次項(xiàng)中,對于酶解產(chǎn)物抑制活性的影響順序?yàn)锳>C>B,其中A、C兩項(xiàng)影響極顯著(p<0.0001),所以初始pH和酶解時間對酶解產(chǎn)物的抑制活性影響較大;在所有的平方項(xiàng)中,A2、B2、C2三項(xiàng)的影響極顯著(p<0.0001);而交互項(xiàng)的影響就相對較小。結(jié)合表3中的F值大小,各因素對堿性蛋白酶酶解大豆豆粕蛋白制備降糖肽的α葡萄糖苷酶抑制率的作用順序依次為:初始pH>酶解時間>酶解溫度。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析圖示 采用DesignExpert 8.0.5軟件,帶入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),分別將模型中的初始pH(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)其中一個因素固定在0水平不變,得到其余兩個因素之間相互作用對于酶解產(chǎn)物抑制活性的影響。通過軟件的Model Graphs分別合成三因素間交互作用的三維圖和等高線圖,結(jié)果見圖6～圖11。

圖6 初始pH與酶解溫度交互作用的三維圖Fig.6 Response surface plots of initial pH value and hydrolysis temperature on the hydrolysates activity

圖7 初始pH與酶解溫度交互作用的等高線圖Fig.7 Contour map of initial pH value and hydrolysis temperature on the hydrolysates activity

圖8 酶解溫度與酶解時間相互作用的三維圖Fig.8 Response surface plots of hydrolysis temperature and time on the hydrolysates activity

圖9 酶解溫度與酶解時間交互作用的等高線圖Fig.9 Contour map of hydrolysis temperature and time on the hydrolysates activity

圖10 初始pH與酶解時間交互作用的三維圖Fig.10 Response surface plots of initial pH value and hydrolysis time on the hydrolysates activity

圖11 初始pH與酶解時間交互作用的等高線圖Fig.11 Contour map of initial pH value and hydrolysis time on the hydrolysates activity

觀察圖6～圖11,可見設(shè)計(jì)的三個因素中對酶解液降血糖活性影響最大的是初始pH,其次是酶解時間,而酶解溫度對活性影響最小。

2.3.3 最佳酶解工藝條件的確定 使用Design-Expert 8.0.5軟件對上述回歸方程進(jìn)行分析,確定最佳酶解工藝條件為:初始pH9.55、酶解溫度48.54 ℃,酶解時間5.29 h。在此工藝條件下,酶解產(chǎn)物的抑制活性預(yù)測值為14.80%。

考慮到實(shí)驗(yàn)條件的可行性等問題,修正酶解工藝條件為:初始pH9.5,酶解溫度49 ℃,酶解時間5.5,在此條件下,3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,得到豆粕降血糖粗肽對α葡萄糖苷酶的抑制活性為14.82%±0.23%,高于預(yù)測值0.02%。同時,由于水解度與酶解產(chǎn)物活性有一定關(guān)系[24],測量發(fā)現(xiàn)該酶解工藝條件下蛋白水解度為23.26%。證明了響應(yīng)曲面分析法對于酶解工藝的優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)曲面優(yōu)化了堿性蛋白酶水解大豆豆粕蛋白制備葡萄糖苷酶抑制劑降糖肽的工藝,獲得的最優(yōu)工藝參數(shù)為:初始pH9.5,酶解溫度49 ℃,酶解時間5.5 h,料液比5∶100,加酶量2%。采用該工藝條件進(jìn)行制備時,蛋白水解度為23.26%,降血糖肽對α葡萄糖苷酶的抑制率為14.82%±0.23%%。研究表明,在此工藝條件下制備的豆粕蛋白葡萄糖苷酶抑制劑降糖肽具有很好的降血糖活性,同時豆粕蛋白作為天然成分，沒有人工合成藥物的副作用。此外,研究還可以進(jìn)一步深入,包括對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定,獲得純品;另外也可以開發(fā)功能性飲料等產(chǎn)品。

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