◎ 曾奕秀，熊雙麗，，薛朝云

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川　綿陽　621010；2.江油市春雨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川　江油　621700）

黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、降血糖及預(yù)防腫瘤等作用[1]，豆腐柴具有顯著的抗炎及預(yù)防腫瘤等功能，這可能與黃酮類化合物有關(guān)[2]。目前，學(xué)者的各類研究當(dāng)中，對豆腐柴葉總黃酮的總抗氧化能力及其他類型的抗氧化活性報道較少。江油豆腐柴是當(dāng)?shù)氐奶厣糜问称?，為更好地研究該地區(qū)豆腐柴資源的生物學(xué)與功能特性，本實驗使用超聲波輔助提取江油豆腐柴葉總黃酮并進(jìn)行其體外抗氧化活性分析，以期為江油豆腐柴資源綜合開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑與儀器

材料：豆腐柴葉，2017年9月采于綿陽江油豆腐柴基地；蘆丁對照品，南京替斯艾么中藥研究所。試劑：二苯基苦基苯肼基自由基（DPPH·），SIGMA ALDRICH公司；乙醇、亞硝酸鈉、鉬酸銨等，均為分析純。儀器：KH3200E型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TDL-4A臺式低速離心機(jī)，上海恰菲爾分析儀器有限公司；UV-5800PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2　豆腐柴葉總黃酮的提取

工藝流程：洗凈的豆腐柴葉→50 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩→準(zhǔn)確稱取1.00 g粉末→按照乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40、超聲溫度70 ℃、超聲時間40 min的參數(shù)進(jìn)行提取→提取液離心（4000 r/min，10 min）→參照張麗丹等人[3]的研究方法測定上清液吸光值，計算豆腐柴葉總黃酮的得率。

1.3　豆腐柴葉總黃酮抗氧化活性的測定

DPPH·、Fe2+螯合能力及總抗氧化能力的測定參考鄭義等人[4]的研究，過氧化氫清除率[5]。

Fe3+還原能力。在劉鵬飛等人[6]研究的基礎(chǔ)上略作修改：在試管中依次加入2.5 mL不同濃度的提取液，2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀水溶液，搖勻，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻，在試管中加入10% 的Cl3CCOOH，搖勻，離心（3800 r/min，10 min）。在試管中加入5 mL上清液，5 mL蒸餾水和1 mL FeCl3水溶液，搖勻，靜置5 min，在700 nm處測定吸光值。

1.4　數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)由Excel 2010處理。

2　結(jié)果與分析

由圖1可知，豆腐柴葉總黃酮及Vit C對 DPPH·清除率都與總黃酮質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且前者優(yōu)于后者，豆腐柴葉總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時對DPPH·清除率趨于穩(wěn)定，為93.01%。周勸娥等[7]的關(guān)于陜西苦菜葉總黃酮的研究發(fā)現(xiàn)，在總黃酮質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL和0.7 mg/mL時，其對DPPH·清除率分別為68.6%和93.6%，而本次實驗在總黃酮質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時，其對DPPH·清除率為74.54%，為0.5 mg/mL時，對DPPH·的清除率已達(dá)94.54%，由此，豆腐柴葉總黃酮對DPPH·的清除率略高于陜西苦菜葉總黃酮，故豆腐柴葉總黃酮表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

圖1　豆腐柴葉總黃酮對DPPH·的清除活性圖

由圖2可知，豆腐柴葉總黃酮和Vit C對H2O2的清除率均隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增大，總黃酮對H2O2的清除率始終高于Vit C。在總黃酮質(zhì)量濃度低于0.04 mg/mL時，豆腐柴圓葉總黃酮對于過氧化氫的清除率明顯高于Vit C，而在總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 mg/mL之后，豆腐柴葉總黃酮與Vit C對H2O2的清除率較為接近，分別為91.18%和89.12%。王靜等[8]對紫（白）蘇葉黃酮類化合物的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，紫（白）蘇葉黃酮分別在0.09～0.12、0.06～0.09 mg/mL，達(dá)到半數(shù)清除率。在此之后，它們對H2O2清除率的增長速度均加快，本實驗在總黃酮質(zhì)量濃度為0.01～0.02 mg/mL達(dá)到半數(shù)清除率，之后其清除率的增加速度呈較緩慢的趨勢。

圖2　豆腐柴葉總黃酮對過氧化氫的清除活性圖

總抗氧化能力可作為衡量提取液體外抗氧化能力的重要指標(biāo)。磷鉬絡(luò)合法是利用當(dāng)樣品溶液和鉬同時存在時它們競爭被還原的原理，通過測定綠色的五價鉬化合物生成量測定總抗氧化能力。由于綠色的五價鉬化合物在695 nm處有最大吸收值，故可通過測定吸光值的大小來判斷物質(zhì)的抗氧化能力強(qiáng)弱，吸光值越大則表示待測物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)[9]。由圖3可知，豆腐柴葉和Vit C的總抗氧化能力均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且Vit C始終略高于豆腐柴葉總黃酮。在吸光值達(dá)到0.6時，豆腐柴葉總黃酮濃度為0.26 mg/mL，與曾林暉等[10]的蜂膠黃酮質(zhì)量濃度為0.33 mg/mL的研究相比，其總抗氧化能力較蜂膠黃酮強(qiáng)。

圖3　豆腐柴葉總黃酮對總抗氧化能力的影響圖

使抗氧化物質(zhì)失電子變?yōu)榉€(wěn)定的分子可使其失去活性。Fe3+易得到電子，抗氧化劑可以提供電子，從而使得Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+，抗氧化劑失去電子的能力越強(qiáng)則表示其還原能力越強(qiáng)。在實驗中，吸光值的大小與抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力呈正相關(guān)。將圖4中豆腐柴葉總黃酮對Fe3+的還原能力的曲線進(jìn)行模擬得到y(tǒng)=4.1321x+0.1308R2=0.9964（y為吸光值，Abs；x為濃度，mg/mL），可見，其有較好的線性關(guān)系。在質(zhì)量濃度為0.31 mg/mL時，豆腐柴葉總黃酮及Vit C對Fe3+具有相同的還原能力。在質(zhì)量濃度低于0.31 mg/mL時，Vit C對Fe3+的還原能力較強(qiáng)，在質(zhì)量濃度高于0.31 mg/mL時，二者趨于一致。本實驗與段宙位[11]得出的沉香葉黃酮類化合物對Fe3+的還原能力經(jīng)線性回歸后符合線性分布的結(jié)論一致。

圖4　豆腐柴葉總黃酮對Fe3+還原能力的影響圖

金屬離子會對人體造成損害，加入抗氧化物質(zhì)可使金屬離子發(fā)生螯合作用，從而減少其對于細(xì)胞的傷害，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)生物機(jī)體的作用[12]。Fe2+的螯合程度越大，物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。由圖5可知，豆腐柴葉總黃酮和Vit C對金屬鐵離子的螯合率隨濃度的增大呈上升趨勢，豆腐柴葉總黃酮的趨勢較為平緩，Vit C上升幅度較大，但在相同的豆腐柴葉總黃酮質(zhì)量濃度的條件下，豆腐柴葉總黃酮提取液對于Fe2+螯合率高于Vit C。

圖5　豆腐柴葉總黃酮對Fe2+螯合能力的影響圖

3　結(jié)語

豆腐柴葉總黃酮具有較好的抗氧化活性，且隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，其中對DPPH·清除率的半數(shù)抑制濃度IC50=0.070 mg/mL，過氧化氫清除率的半數(shù)抑制濃度IC50=0.011 mg/mL，對Fe3+還原能力及Fe2+螯合能力均有較好的線性關(guān)系，使用超聲波提取的豆腐柴葉總黃酮的總抗氧化能力較強(qiáng)。

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