陳龍，張珂，劉雪瀅，夏祥，黃健，王航宇，王金輝，**

（1 石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子，832002；2 蘭州和盛堂制藥股份有限公司，甘肅 蘭州730000；3 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150081）

七味冬青葉散由冬青葉、北沙參、甘草、天竺黃、丹參、杜鵑葉和苦杏仁七味藥材組成，用于止咳、化痰、平喘、潤肺；急慢性氣管炎、支氣管炎，肺纖維化，支氣管擴(kuò)張及肺炎，為內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室配制。方中丹參具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰等功效，丹酚酸B 為丹參主要指標(biāo)性成分，且具有抗氧化、抗纖維化等作用[1-4]?？嘈尤示哂袧櫡巍⒅箍?、滑腸等功效，苦杏仁苷為苦杏仁主要指標(biāo)性成分，常作為祛痰止咳劑、輔助性抗癌藥物[5，6]。杜鵑葉具有清熱解毒，止血，化痰止咳等功效，杜鵑素為杜鵑葉主要指標(biāo)性成分[7-8]。

目前，對于該制劑的測定方法尚未見報道，為了更有效的控制該制劑質(zhì)量，本實驗建立了同時測定七味冬青葉散中苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素的RP-HPLC 方法，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters 2695 型高效液相色譜儀，Waters 2998 型檢測器，Empower 2.0 色譜工作站，DV215CD 型十萬分之一電子分析天平（美國Ohaus 公司），KQ3200B型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），XH-C型旋渦混合儀（金壇市醫(yī)療儀器廠），F(xiàn)W-100 型高速萬能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），TGL-16G 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

七味冬青葉散（哲衛(wèi)準(zhǔn)字9604-105 號，生產(chǎn)批號：20150426，規(guī)格：15 g），苦杏仁、丹參、杜鵑葉均由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，杜鵑素（批號：110850-201605，中國食品藥品檢定研究院），苦杏仁苷（批號：110820-201607，中國食品藥品檢定研究院），丹酚酸B（批號：111562-201716，中國食品藥品檢定研究院），甲醇（色譜級，J.K Baker 公司，美國），分析級磷酸（武漢化學(xué)試劑廠），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

1.2.1.1 檢測波長的選擇

參照中國藥典2015 版一部正文苦杏仁、丹參、杜鵑項下，分別選擇在210、286、297 nm 波長處測定含量。

1.2.1.2 流動相的選擇

色譜柱：Sunfire C18 （150 mm ×4.6 mm，5 μm），流動相A：甲醇，流動相B：0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0 ～15 min：20% A →20% A、15 ～20 min：20% A →42% A、20 ～36 min：42% A →42%A、36～40 min：42% A→65% A、40～50 min：65%A→65% A，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素各適量，分別置于5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.018、0.9740 和0.9940 mg/mL 的苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素對照品儲備溶液。

精密吸取1.018、0.9740 和0.9940 mg/mL 的苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素對照品儲備溶液適量，置于5 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1mL 含苦杏仁苷407.2 μg、丹酚酸B 389.6 μg、杜鵑素19.80 μg 的混合溶液A。

精密吸取1.018、0.9740 和0.9940 mg/mL 的苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素對照品儲備溶液適量，置于100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，搖勻即得每1mL 含苦杏仁苷217.0 μg、丹酚酸B 158.5 μg、杜鵑素5.900 μg 的混合溶液B。

1.2.3 陰性樣本溶液的制備

取冬青葉、北沙參、甘草和天竺黃各藥材適量，粉碎成細(xì)粉，過60 目篩，取過篩后細(xì)粉按照處方中一定比例配制樣品，混合均勻后置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱取重量，室溫下超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（8000 r/min，10 min），離心后吸取上清液用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得陰性樣本溶液。

1.2.4 供試品溶液的制備

1.2.4.1 七味冬青葉散溶液的制備

取七味冬青葉散粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，搖勻，稱定重量，室溫下超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（8000 r/min，10 min），離心后吸取上清液用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取濾液作為七味冬青葉散供試品溶液，每次吸取10 μL注入高效液相色譜儀中分析。

1.2.4.2 苦杏仁、丹參、杜鵑葉供試品溶液的制備

取各藥材適量，粉碎，過60 目篩，精密稱定苦杏仁粉末約0.1 g、丹參及杜鵑葉粉末約0.25 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱定重量，室溫下超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（8000 r/min，10 min），離心后吸取上清液用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得苦杏仁、丹參及杜鵑葉供試品溶液，吸取各供試品溶液10 μL 注入高效液相色譜儀中分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察

精密吸取甲醇溶劑、陰性樣本溶液、混合溶液A和七味冬青葉散供試品溶液在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子均在0.95～1.05 之間，理論板數(shù)按丹酚酸B 峰計算大于5000，在對照品色譜峰位置處，供試品具有相同保留時間的色譜峰，空白溶劑甲醇在此保留時間處無色譜峰，各藥材在相同波長下具有同一保留時間的色譜峰（圖1）。

圖1 空白溶劑、對照品、供試品和陰性溶液的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of blank solvent，reference substance，sample and negative solution

2.2 線性關(guān)系考察

取混合溶液A，分別精密吸取1、2、6、10、14、18、22 μL 在“2.1”色譜條件下注入高效液相色譜儀分析，以混合對照品溶液中各對照品的濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，計算回歸方程，結(jié)果顯示苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，所得回歸方程及線性范圍見表1。

表1 苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素的線性回歸方程n=7Tab.1 Regression equation of nitrilosides，salvianolic acid B and farrerol

2.3 精密度試驗

取同一混合溶液A 重復(fù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣量10 μL。計算苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素峰面積的RSD 值分別為：0.70%、0.55%和0.45%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取室溫下放置的同一份七味冬青葉散供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、18、20 h 進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，測得苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素的峰面積的RSD 值分別為1.3%、0.94%和0.86%，表明七味冬青葉散供試品在室溫下放置20 h 穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一批號七味冬青葉散供試品6 份，按“2.4.1”供試品制備方法制得供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，測得苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素的含量分別為0.43%、0.32%、0.012%，RSD 值分別為1.5%、1.9%和1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗

取已測含量的同一批次七味冬青葉散供試品6 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入與樣品中各成分等量的混合對照品溶液B 10 mL，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，測得苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素平均回收率結(jié)果見表2。

表2 苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素的回收率測定結(jié)果 n=6Tab.2 Recovery of nitrilosides，salvianolic acid B and farrerol

2.7 樣品測定

取七味冬青葉散按“2.4.1”方法制備供試品溶液，苦杏仁、丹參、杜鵑葉按“2.4.2”方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，每次進(jìn)樣10 μL，測定各樣品苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素的含量，結(jié)果見表3。

以七味冬青葉散中苦杏仁苷為例，稱取七味冬青葉散粉末1.00297 g，加入色譜甲醇10 mL，超聲離心處理后，進(jìn)入液相分析，進(jìn)樣量為10 μL，計算結(jié)果為：

供試品溶液的濃度=1.00297g/10mL=0.100297 g/mL=100.297 mg/ml=100.297 μg/μL。100.297 μg/μL×0.436%=0.4372949 μg/μL。

進(jìn)樣量G=0.4372949 μg/μL×10 μL=4.372949 μg?？嘈尤受者M(jìn)樣量G 的范圍為：0.4072-8.958 μg，符合范圍。

同理，單味藥材以杜鵑葉中杜鵑素為例，稱取杜鵑葉粉末0.25240 g，加入25 mL 色譜甲醇，超離心處理后，進(jìn)入液相分析，進(jìn)樣量為10 μL，計算結(jié)果為：

杜鵑葉供試品溶液的濃度=0.25240 g/25 mL=0.010096 g/mL=10.096 mg/mL=10.096 μg/μL。0.096 μg/μL ×0.088%=0.00888448 μg/μL。進(jìn)樣量G=0.00888448 μg/μL×10 μL=0.0888448 μg。杜鵑素 進(jìn)樣量G 的范圍為0.01988-0.4374 μg，符合范圍。

表3 樣品含量測定結(jié)果 n=3Tab.3 Results of the contents determination of samples

3 討論

（1） 參照2015 版《中華人民共和國藥典》，苦杏仁苷的最大吸收波長為210 nm，丹酚酸B 的特征吸收波長為286 nm，杜鵑素的最大吸收波長為297 nm，在本實驗中，選用了210、286、297 nm 為檢測波長，能兼顧各個組分的檢測，且各組分響應(yīng)值均勻，具有良好的代表性。

（2） 為了使苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鵑素更好的分離，且不受其他組分和溶劑的干擾，在方法建立的過程中，對流動相的組成進(jìn)行了優(yōu)化，采用乙腈-0.1%的磷酸溶液、甲醇-0.1%的磷酸溶液和甲醇- 水為流動相，梯度洗脫。結(jié)果顯示，以甲醇為有機(jī)相的流動相系統(tǒng)，分離效果好，加入磷酸使峰型得到了優(yōu)化，故選擇甲醇-0.1%的磷酸溶液作為流動相。

（3）考察了提取溶劑用量對提取率的影響，分別選擇了10 mL、25 mL 的甲醇對供試品進(jìn)行超聲提取30 min，結(jié)果顯示，溶劑用量為10 mL 時，既可以將上述3 種成分完全提取，同時也滿足實驗中3 種成分的用量，因此，本實驗選擇10 mL 甲醇提取溶劑，超聲時間30 min 作為供試品的處理方法。

本方法快速簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性高，應(yīng)用于七味冬青葉散的含量測定，完善其質(zhì)量控制。