丁華建，王金晶，朱佳琪，鄭梅瑩，鄭飛云，李永仙，鈕成拓，劉春鳳，李崎

1 江南大學 生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫　214122

2 江南大學 釀酒科學與工程研究室，江蘇 無錫　214122

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是人類了解最早、應用最廣泛的一種酵母，主要應用于面包、酒類等發(fā)酵。釀酒酵母具有生長周期短、發(fā)酵能力強、容易進行大規(guī)模培養(yǎng)以及含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、生物活性物質(zhì)等豐富的營養(yǎng)成分等優(yōu)點，一直是基礎及應用研究的主要對象，在食品、醫(yī)藥等領域應用廣泛。酵母的重復利用在工業(yè)生產(chǎn)尤其是釀造行業(yè)中被廣泛接受并應用，以降低生產(chǎn)成本，使菌株發(fā)揮更大的應用價值。然而隨著回用次數(shù)的增加，釀酒酵母不可避免地出現(xiàn)逐漸衰老的現(xiàn)象，導致其發(fā)酵能力發(fā)生下降至影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量[1]，因此在生產(chǎn)中對酵母的活力以及性能提出了更高的要求。

對細胞衰老機理的研究一直是生命科學領域所關注的問題，而 Botstein等發(fā)現(xiàn)釀酒酵母有將近31%編碼蛋白質(zhì)的基因或者開放閱讀框與哺乳動物編碼蛋白質(zhì)的基因有高度的同源性[2]，因此釀酒酵母被認為是研究細胞生理分子機制以及高等真核生物病理生理過程的重要模型系統(tǒng)，常被用于衰老機制的研究[3]。衡量釀酒酵母的衰老有兩種模式，時序衰老 (Chronological aging) 和復制衰老 (Replicative aging)。而與此相應的釀酒酵母的壽命也有兩種定義方式，即時序壽命(Chrononical lifespan,CLS) 和復制壽命(Replicative lifespan,RLS)，前者指一定條件下單個細胞的存活時間，后者指酵母細胞在死亡之前的分裂次數(shù)[4-5]。釀酒酵母在連續(xù)傳代的情況下，酵母的各項生理指標會因為一些脅迫條件 (如溫度高低、乙醇積累、pH上升以及滲透壓上升等)的變化，在某種程度上影響其衰老。本文綜述了釀酒酵母在連續(xù)傳代過程中細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化、細胞的絮凝性、活力以及胞內(nèi)多種酶活性等的變化趨勢。

1　細胞形態(tài)

細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)決定了細胞的功能，而細胞的功能則影響了細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。酵母細胞在連續(xù)傳代過程中，培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)基成分在轉(zhuǎn)接時發(fā)生劇烈變化，酵母在感受到外界環(huán)境變化時會啟動其自身系列調(diào)控系統(tǒng)用以維持細胞的基本形態(tài)、大小以及出芽的比率等。

正常發(fā)酵過程中，酵母細胞一般多呈橢圓形、圓形，表面圓潤飽滿，有明顯的出芽現(xiàn)象和芽痕。通過對不同代數(shù)的酵母細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)第 1代和第2代的酵母細胞表面圓潤飽滿、光滑無褶皺，且大部分為橢圓形的單細胞狀態(tài)，細胞之間沒有相互附著現(xiàn)象。但是到了第15代之后，細胞表面就會布滿褶皺，形態(tài)近似圓形，有許多細胞聚集成團，只有個別的細胞還處于單細胞狀態(tài)[6]。但是當這些酵母細胞處于營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中時，通過掃描電鏡 (Scanning electronic microscopy,SEM) 和透射電鏡 (Transmission electron microscope，TEM) 對細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)一般會在第5代左右就出現(xiàn)嚴重的褶皺變化，細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)會逐漸水解，同時細胞的大小也發(fā)生一定的變化(圖 1、2)。說明隨著傳代次數(shù)的增加，細胞衰老過程在細胞形態(tài)尤其是細胞壁上的反應愈加明顯。同時研究還表明經(jīng)過多次分裂后，細胞壁表面的芽痕[7]增多，細胞的形態(tài)趨向于圓形，這可能是胞內(nèi)抗氧化酶在經(jīng)過多次傳代后活性降低，引起的胞內(nèi)自由基積累，而自由基的存在對細胞產(chǎn)生了毒害作用，從而引起細胞形態(tài)的變化[8]。再者，在傳代的過程中由于環(huán)境變化的影響，釀酒酵母不可避免地發(fā)生自溶[9]，其細胞形態(tài)也發(fā)生了大幅度的變化。

2　細胞壁

釀酒酵母細胞壁是一個動態(tài)的且被調(diào)控得非常有序的細胞結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和組成被嚴格調(diào)控并能通過全局應答系統(tǒng)對環(huán)境變化作出廣泛地響應[10]。

圖1　第1代與第5代釀酒酵母在掃描電鏡下的形態(tài)變化Fig. 1　The SEM image of S. cerevisiae of first and fifth generation. (A) Morphology of the G1 yeast cells under the condition of nutrient deficiency. (B) Morphology of the G5 yeast cells under the condition of nutrient deficiency.

圖2　第1代與第5代釀酒酵母在透射電鏡下的形態(tài)變化Fig. 2　The TEM image of S. cerevisiae of first and fifth generation. (A) Morphology of the G1 yeast cell under the condition of nutrient deficiency. (B) Morphology of the G5 yeast cell under the condition of nutrient deficiency.

釀酒酵母細胞壁為雙層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層是由β-1,3-葡聚糖和 β-1,6-葡聚糖組成的葡聚糖層，在出現(xiàn)牙痕的附近還含有一定數(shù)量的幾丁質(zhì)。外層是由性質(zhì)不同的各種甘露糖蛋白組成。在酵母細胞壁中，甘露糖蛋白是酵母細胞壁的重要組成部分，它除了可以參與酵母細胞之間的交配外，還與菌落形態(tài)變化以及生物大分子的免疫識別等相關[11]。當酵母細胞的生長環(huán)境發(fā)生異常變化或細胞壁結(jié)構(gòu)受到破壞時，細胞壁表面感受壓力因子將信號傳遞給細胞，然后再通過細胞壁完整性 (Cell wall integrity,CWI) 途徑或高滲透性甘油(High osmolarity glycerol,HOG) 途徑等及時進行調(diào)節(jié)，來抵抗不良環(huán)境，減少對細胞的損害[12-13]。

成建國[14]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在傳代的過程中，酵母細胞壁內(nèi)層的骨架結(jié)構(gòu)成分葡聚糖所占比例隨著代數(shù)的增加逐漸積累，而對細胞壁蛋白起修飾作用的甘露糖含量則逐漸減少。研究表明當這些酵母細胞處于營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中時，細胞壁的變化更加明顯，正常發(fā)酵條件下酵母細胞壁的厚度增加趨勢緩慢，而在營養(yǎng)匱乏的條件下，厚度增加的趨勢明顯加快，第一代細胞壁厚度維持在0.2 μm左右，到了第5代已經(jīng)達到0.3 μm左右。分析酵母菌骨架結(jié)構(gòu)層 (葡聚糖) 的聚合度變化時，發(fā)現(xiàn)在傳代過程中，酵母菌細胞壁內(nèi)層葡聚糖的聚合度隨著代數(shù)的增加而逐漸降低，而且葡聚糖組成中的 β-1,6-糖苷鍵比例降低，β-1,3-糖苷鍵比例增加。

酵母菌在傳代的過程中，由于細胞的代謝能力逐漸下降，使細胞內(nèi)的甘露糖合成酶活力下降,對細胞壁蛋白質(zhì)的糖基化修飾就會降低，最終導致甘露糖含量的下降。雖然甘露糖的含量在逐漸減少，但是菌體自身為了維持正常的生理代謝活動，通過CWI以及HOG等途徑調(diào)節(jié)發(fā)生快速修復，合成更多的葡聚糖來彌補甘露糖的減少以及其自身聚合度的下降對細胞造成的傷害，因此總體上仍然導致了細胞壁的加厚。由于酵母內(nèi)壁葡聚糖層逐漸變厚，它的增厚導致菌體外形發(fā)生微小變化，由橢圓形逐漸趨于圓形。酵母菌細胞壁出現(xiàn)這些重要變化是酵母菌自我保護的一種代謝調(diào)節(jié)能力的體現(xiàn)，因此，當酵母菌對環(huán)境等不良因素的抵抗能力減弱時就會通過合成更多的葡聚糖加厚細胞壁來阻止外界大分子物質(zhì)進入細胞內(nèi)破壞細胞[15]。

3　絮凝性

絮凝性是酵母在發(fā)酵工業(yè)如啤酒釀造中體現(xiàn)的一個重要特性。目前對酵母絮凝性機理有多種假說，但影響最廣泛的就是類外源凝集素 (Lectin-like)假說，即酵母細胞外壁的表面蛋白質(zhì)或糖蛋白與其他酵母細胞壁的甘露糖殘基特異性結(jié)合導致絮凝[16]。從分子學的角度來看，酵母絮凝是由整個FLO基因家族編碼的絮凝蛋白與鄰近細胞的胞壁甘露糖結(jié)合形成的多細胞聚集沉降現(xiàn)象，是成千上萬個細胞形成的可逆的、無性的、需要Ca2+的過程[17-18]。酵母的絮凝不僅受遺傳因子的控制，而且受環(huán)境和生理等因素的影響[19]。酵母細胞在連續(xù)傳代的過程中，細胞會逐漸衰老，而酵母的衰老影響細胞的表面特性，尤其是細胞表面的疏水性，從而影響酵母細胞的絮凝性[20]。

酵母細胞在傳代的過程中，其細胞形態(tài)及表面特性會逐漸發(fā)生變化，與母細胞相比，子細胞的再生殖有所緩慢，絮凝能力有所降低[21]。大多數(shù)釀酒酵母在發(fā)酵初期喪失絮凝能力，而在指數(shù)后期或穩(wěn)定期時酵母細胞表面的疏水相互作用達到最大，粘附性最強，因此又重新獲得絮凝的能力[22]。一般菌齡較長的酵母細胞絮凝能力更強。另外，形態(tài)學研究表明，隨酵母細胞菌齡的增長，細胞壁出現(xiàn)褶皺狀變化，細胞間聯(lián)系更加緊密，細胞間的粘連更加容易，這可以部分解釋酵母在不同生長時期表現(xiàn)出不同絮凝能力的現(xiàn)象。

也有許多研究者認為，酵母菌細胞壁在絮凝過程中起著重要的作用，而其中的細胞壁蛋白質(zhì)在酵母菌的絮凝中發(fā)揮著更加明顯的作用[23-24]。安文濤等[25]以及 Potter[26]發(fā)現(xiàn)在酵母菌連續(xù)傳代過程中，酵母菌細胞壁蛋白質(zhì)的糖基化修飾程度在減弱，而糖基化修飾程度的降低使大量蛋白質(zhì)在酵母菌細胞表面裸露，這對細胞表面張力的維持帶來了一定的負作用，引起細胞壁表面各種力的變化，最終導致酵母菌絮凝性加強。

4　細胞活力

人類利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)各種食品、化工產(chǎn)品已有非常長的歷史，然而酵母發(fā)酵產(chǎn)生這些代謝產(chǎn)物也會造成酵母菌生存環(huán)境的不斷改變，使其面臨各種脅迫條件的影響，如溫度、乙醇、pH以及滲透壓等[27]。因此在進行連續(xù)傳代的過程中，酵母的活力會因為這些脅迫條件的影響而發(fā)生一些改變。

評價細胞的活力有兩種方式，一個是活細胞的占比率 (Viability)；另一個是細胞的生理能力(細胞存活，但是無分裂能力)，也叫細胞活性(Vitality)。通常情況下兩種方式需要結(jié)合來反映細胞的活力[28]。研究表明，酵母細胞在傳代的過程中，其細胞活力逐漸下降，其活力的下降趨勢和程度在不同菌株之間又表現(xiàn)不同。對兩株lager型啤酒酵母Pilsner和5-2進行研究發(fā)現(xiàn)，比較0代和5代酵母，其死亡率都從0上升至5%左右，而菌株的活性下降則有明顯的區(qū)別。Pilsner和 5-2的活性分別由0代的99%下降到第5代的45%和60%左右，其細胞活性的下降正說明了其不斷衰老的過程。另外，酵母細胞的活力除了反映生理功能，還包括了細胞的代謝活力。由此也證明了細胞的死亡率并不能作為單一的評價指標對酵母的活力活性進行評價。

酵母的主要能量來源為葡萄糖，對葡萄糖的代謝能力直接反映了細胞的代謝活力。葡萄糖代謝活力以培養(yǎng)基或發(fā)酵液中殘留葡萄糖濃度來表示，殘留的葡萄糖濃度越低酵母的代謝越快，代謝活力就越強。姚繼兵等[6]、季楊楊[29]等研究發(fā)現(xiàn)當釀酒酵母連續(xù)培養(yǎng)到第 10代時其降糖的速率比第2代略有降低，而當培養(yǎng)到第15代時與第10代相比，降糖速率明顯降低。此外，不同代數(shù)酵母在指數(shù)生長期時降糖速率基本一致，而在生長穩(wěn)定期時，不同代數(shù)酵母降糖速率有明顯差異。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是指數(shù)期酵母分解葡萄糖是用于細胞的分裂生長繁殖，而在穩(wěn)定期表現(xiàn)的現(xiàn)象則說明隨著酵母菌的傳代次數(shù)增多，酵母的細胞活性下降，發(fā)酵能力降低，代謝能力越來越弱。

另外，也有一些學者對提高細胞活力和活性進行了研究。海藻糖是一類非常重要的壓力保護劑，海藻糖的抗氧化壓力主要體現(xiàn)在其保護細胞免受氧自由基破壞。研究發(fā)現(xiàn)，與海藻糖降解相關的基因 (NTH1、NTH2、ATH1) 受應激反應元件 (The stress responsive element,core consensus CCCCT，STRE) 的調(diào)控[30-31]。在酵母衰老的過程中，與海藻糖降解相關基因NTH1和ATH1的表達水平發(fā)生了相應的下調(diào)，使海藻糖降解速度減慢，從而保證了海藻糖在酵母細胞中的積累，保護細胞不受氧自由基損傷[32]。因此Hirasawa等通過在酵母細胞的培養(yǎng)中添加適量海藻糖，發(fā)現(xiàn)細胞的抗凍性會顯著增加，同時細胞的發(fā)酵能力和活性會有效改善[33]；此外，Magalh?es等研究表明豐富的黃腐酚雖然對酵母活性沒有顯著影響，但對酵母活力卻有一定的積極作用，同時黃腐酚對酵母的生理狀態(tài)也有積極的影響[34]。

5　胞內(nèi)酶活性變化

酵母細胞內(nèi)含有多種酶，如抗氧化酶、蛋白酶、脂肪酶、蔗糖酶、淀粉酶等[35-37]。在工業(yè)生產(chǎn)中，隨著酵母使用代數(shù)的增加，酵母酶活力因為各種培養(yǎng)條件或脅迫環(huán)境等因素的影響發(fā)生變化，而其酶活力高低則直接影響發(fā)酵的效率和產(chǎn)物質(zhì)量。

5.1　抗氧化酶

酵母細胞內(nèi)的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT) 和過氧化物酶 (Peroxidase，POD)。SOD、CAT和POD是生物體內(nèi)主要抗氧化酶系統(tǒng)。在正常情況下，3種酶聯(lián)合清除活性氧自由基(ROS)，保護自身免受自由基傷害[38]。

研究發(fā)現(xiàn)[39]隨著酵母傳代次數(shù)的增加，酵母細胞內(nèi)3種抗氧化酶的活性呈現(xiàn)出先增加后減小的變化趨勢，因此導致了胞內(nèi)活性氧自由基的含量出現(xiàn)了先下降后上升的現(xiàn)象，這與在前期研究中發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi) ROS出現(xiàn)先降低再升高的趨勢相一致?？寡趸赶档淖饔孟率辜毎械淖杂苫豢焖偾宄?，ROS出現(xiàn)下降趨勢，使得細胞不被自由基破壞；當酶活性上升到最大值后開始下降，細胞內(nèi)自由基的積累和清除失去平衡。因此，過多的ROS積累氧化細胞膜脂、蛋白質(zhì)以及DNA等生物大分子，會對細胞產(chǎn)生不可逆的傷害，細胞結(jié)構(gòu)會受到一定程度的損傷[40]，這也解釋了為什么酵母細胞在經(jīng)過連續(xù)傳代后細胞表面布滿褶皺，細胞呈現(xiàn)逐漸衰老的趨勢。

5.2　其他酶類

在酵母細胞內(nèi)除了有保護細胞免受活性氧自由基傷害的抗氧化酶外，還有在酵母的生理代謝活動中起著重要作用的蛋白酶、脂肪酶、蔗糖酶等一些酶類。

張利等[41]通過對不同代數(shù)的酵母進行蛋白酶、脂肪酶和蔗糖酶等酶活力測定，發(fā)現(xiàn)酵母蛋白酶活力隨著酵母代數(shù)的增加而升高，而脂肪酶以及蔗糖酶活力都在逐漸下降。在酵母連續(xù)傳代過程中，當細胞內(nèi)蛋白酶活力得到明顯增加時，就會加速催化水解酵母細胞壁和細胞膜上的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分子水解成游離氨基酸，使細胞失去穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和活性。脂肪酶、蔗糖酶在酵母細胞中的作用主要是通過水解大分子的脂肪、蔗糖等物質(zhì)以供給細胞代謝所需要的能量，酵母細胞內(nèi)的脂肪酶和蔗糖酶的活性在傳代的過程中逐漸降低，說明酵母在傳代的過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率逐漸降低，反映了酵母的代謝能力在逐漸減弱，細胞在逐漸衰老。

6　胞外多糖的代謝

胞外多糖 (Extracellular polysaccharides，EPS)[42]由微生物產(chǎn)生后分泌到細胞外，一般由單糖和一些非糖基 (如乙酸鹽、丙酮酸、琥珀酸等)所組成，是易與菌體分離且可以通過深層發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一類代謝物。由于胞外多糖的組成具有多樣性，因此胞外多糖在各種食品和制藥行業(yè)有著廣泛應用。釀酒酵母胞外多糖作為多糖中的一種，具有多種生理活性，除了能夠提高機體免疫活性外，還具有抗病毒、抗氧化和抑制腫瘤生長等作用[43]。而酵母多糖除了甘露寡聚糖、β-葡聚糖等細胞壁多糖外，更多的是與酵母菌生理密切相關的，由葡萄糖在酵母菌細胞內(nèi)合成,然后通過某種機制分泌到細胞外的胞外多糖[44]。

研究發(fā)現(xiàn)[45]，在進行酵母菌傳代培養(yǎng)的過程中，隨著傳代次數(shù)的增加，酵母菌的代謝能力逐漸下降，胞外多糖的分泌速度和含量也都在降低。酵母菌胞外多糖含量的降低與其代謝糖能力降低是密切相關的，在這個層面上多糖含量的變化與殘?zhí)窍牡臏p少表現(xiàn)出了一致性，然而其占葡萄糖代謝總量的比例卻隨著傳代次數(shù)的增加有了小幅度的提升，可以推測，酵母菌胞外多糖與酵母菌抗衰老有一定的關系。

7　展望

酵母的回收利用在工業(yè)生產(chǎn)中不可避免，而酵母在傳代過程中生理變化及衰老機制的研究并不深入。雖然了解到酵母的時序衰老和復制衰老模式，但是酵母的衰老是一個多因素的現(xiàn)象，其詳細的機制仍然未知，所以這一問題的成功解決將為酵母大工業(yè)生產(chǎn)中存在的問題起到積極影響，另外也為多細胞真核生物的衰老研究提供研究基礎。結(jié)合當前研究中遇到的困難，可以嘗試從以下兩方面進行研究：1) 雖然釀酒酵母的衰老有兩種模式，但是兩者之間也有許多相同點，如氧化壓力的增加、細胞凋亡的發(fā)生等?？梢試L試跟蹤兩者共有特征來研究酵母的衰老。2) 酵母在傳代過程中各種組學信息包括轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學以及代謝組學的分析將為酵母細胞在傳代中的生理代謝變化提供遺傳信息支持，有助于對酵母的生理變化及對外界環(huán)境壓力應答有一個更加全面系統(tǒng)的了解。通過對酵母細胞衰老機制的不斷探究，能夠更全面地認識酵母在工業(yè)應用中的衰老，將為酵母在工業(yè)生產(chǎn)中更廣泛的應用提供理論基礎。

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