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心力衰竭為各種心臟疾病的嚴重階段，隨著高血壓、冠心病等心血管疾病發(fā)病率的增加，最終發(fā)展為心力衰竭的人群也逐漸增多[1]。雖然西醫(yī)治療慢性心力衰竭已取得進展，但存在副作用較大、應(yīng)用禁忌等問題。中醫(yī)藥具有副作用小及組方靈活等優(yōu)勢，在治療慢性心力衰竭方面發(fā)揮重要作用，值得進一步深入研究。芪參顆粒是研究團隊臨床長期應(yīng)用經(jīng)驗方，由黃芪、丹參、金銀花、甘草等藥味組成，適于心力衰竭陽(氣)虧虛、瘀“毒”內(nèi)阻證，具有“簡效驗廉”的優(yōu)勢。課題組前期研究表明芪參顆粒對心肌缺血所致心力衰竭模型具有改善心功能、延緩心室重構(gòu)的作用[2-3]，但其物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制尚未完全闡明。心力衰竭的病理生理機制復(fù)雜，交感系統(tǒng)過度激活是其重要機制之一。芪參顆粒是否通過調(diào)節(jié)交感系統(tǒng)活性治療心力衰竭，是否對交感系統(tǒng)過度激活導致的心力衰竭有效？為了解答上述問題，本實驗擬觀察芪參顆粒干預(yù)過量異丙腎上腺素致小鼠心力衰竭的療效，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預(yù)測其作用靶點，進一步闡明芪參顆粒作用特點及機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康C57BL雄性小鼠24只，體重20 g±1 g，購于北京維通利華實驗動物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，恒溫、恒濕，自由飲水，普通飼料。

1.2藥物與試劑芪參顆粒由黃芪、丹參、金銀花、甘草等中藥組成，各藥材飲片均購于北京同仁堂制藥有限公司，按照課題組前期建立的方法制備[4]。福辛普利(批準文號：國藥準字H19980197)由中美上海施貴寶制藥有限公司提供。異丙腎上腺素(批號：101722747)由西格瑪-奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司提供。

1.3儀器與材料加拿大VisualSonics公司高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)Vevo 2100，配有30 MHz探頭；1 mL注射器、小鼠灌胃針、1.5 mL離心管、1.0 mL凍存管等。

1.4網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)庫在線中醫(yī)藥生物信息學分析工具(BATMAN-TCM)[5]。

1.5方法

1.5.1分組與造模小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體重隨機分為模型組、空白組、芪參顆粒組、福辛普利組。心力衰竭模型制作采用本研究團隊經(jīng)典的鹽酸異丙腎上腺素梯度造模法：第1日20 mg/kg，第2日10 mg/kg，第3日～第14日 5 mg/kg給予小鼠皮下注射異丙腎上腺素[6]。給藥組和模型組按上述方案，皮下注射異丙腎上腺素。空白組皮下注射生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。從造模即日起，福辛普利組每日予福辛普利5.5 mg/kg，芪參顆粒組每日予芪參顆粒44 g/kg(以生藥量計)；模型組與空白組動物給予同體積純凈水。連續(xù)給藥14 d。

1.5.2小鼠心臟超聲檢測實驗終點，采用VisualSonics Vevo 2100小動物高分辨率顯微超聲成像系統(tǒng)評價各組實驗小鼠的心臟結(jié)構(gòu)及功能，測量左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular internal systolic diameter，LVIDs)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)，計算射血分數(shù)(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)。每只動物采樣3次，記錄3個心動周期的平均值用于后續(xù)分析。

1.5.3心臟指數(shù)計算實驗終點，測量小鼠體質(zhì)量。小鼠腹腔麻醉、處死后，迅速開胸，摘取心臟，用預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)沖洗心腔血塊，剪除心臟周圍結(jié)締組織和血管，稱取心臟重量，計算心臟指數(shù)。心臟指數(shù)=心質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.5.4病理學檢測心臟組織采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察并記錄病變情況。

1.5.5網(wǎng)絡(luò)藥理學分析在BATMAN-TCM在線網(wǎng)站鍵入芪參顆粒的組方中藥，得到藥物治療疾病與靶點交互數(shù)據(jù)集。

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠心功能比較造模后14 d，與空白組比較，模型組LVIDs、LVIDd顯著增加(P<0.05)，EF和FS顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，芪參顆粒組心力衰竭小鼠心室LVIDs顯著降低(P<0.05)，有降低LVIDd趨勢(P=0.05)，EF與FS提高(P<0.05)。與模型組比較，福辛普利心力衰竭小鼠LVIDd差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，EF值與FS值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由此可見，芪參顆粒治療過量異丙腎上腺素誘導的心力衰竭可能較福辛普利更顯著。詳見表1。

表1　各組小鼠心功能比較(±s)

2.2心臟指數(shù)與空白組比較，模型組心臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，芪參顆粒組可有效降低心力衰竭小鼠心臟指數(shù)(P<0.05)，與陽性對照藥福辛普利作用相近。詳見圖1。

2.3病理學檢測HE染色結(jié)果顯示，模型組動物心肌組織血管管腔、管徑增大，血管壁增厚，伴有壁外側(cè)結(jié)締組織增生和炎細胞浸潤。與模型組比較，芪參顆粒組動物心肌組織的病變程度顯著減輕。福辛普利組也有類似的改善作用。詳見圖2。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

圖1芪參顆粒對ISO致心力衰竭小鼠心臟指數(shù)的影響

圖2心肌組織HE染色病理學圖

2.4芪參顆粒治療心力衰竭的靶標預(yù)測網(wǎng)絡(luò)藥理學作為系統(tǒng)生物學的研究方法，引入中藥復(fù)方治療心血管疾病中，為研究中藥復(fù)方治療心血管等復(fù)雜疾病的藥理學機制和靶點預(yù)測提供高通量數(shù)據(jù)。檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，芪參顆粒治療心力衰竭的靶點共15個，芪參顆粒治療心力衰竭前10位對應(yīng)靶點，與心力衰竭經(jīng)典通路基本吻合。詳見表3。

3　討　論

異丙腎上腺素能增強心肌收縮力，模擬壓力超負荷型心力衰竭，具有無創(chuàng)、安全性高、均一性好的優(yōu)勢，在目前心力衰竭動物模型中得到廣泛使用。通過本研究發(fā)現(xiàn)芪參顆?？筛纳飘惐I上腺素致心力衰竭小鼠的心功能，尤其在延緩心力衰竭進程中以心室擴大為主要表現(xiàn)的心肌重塑，能有效減少LVIDs和LVIDd，提示芪參顆粒對交感系統(tǒng)過度激活引起的心力衰竭有較好療效，調(diào)節(jié)交感系統(tǒng)可能是其作用機制之一。

運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法觀察芪參顆粒治療疾病的分布情況，將其與相關(guān)靶點進行對接，并根據(jù)疾病與靶點的相關(guān)性推測芪參顆粒治療心力衰竭可能的機制。計算結(jié)果表明，芪參顆粒治療慢性心力衰竭的作用機制靶點包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、α2型腎上腺素受體(α2-AR)、1型血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體、腫瘤壞死因子(TNF)等。AngⅡ降低，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活性、調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)、抑制TNF等炎癥介質(zhì)生物合成，改善心功能、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)等重要作用環(huán)節(jié)。

RAS過度激活是心力衰竭發(fā)病的啟動環(huán)節(jié)，因此已成為心力衰竭治療的主要靶點[7]。ACE作為RAS的核心酶 ，催化產(chǎn)生RAS關(guān)鍵的效應(yīng)因子AngⅡ，發(fā)揮血管收縮、細胞增殖、促進心肌重構(gòu)的作用。AGTR1為1型AngⅡ受體，1型受體認為是調(diào)解AngⅡ的主要心血管效應(yīng)[8]。

α2-AR包括3個高度同源的亞型：alpha 2A 、alpha 2B、alpha 2C[9]。α2-AR通過識別并選擇性地與兒茶酚胺類物質(zhì)特異性結(jié)合，引起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路激活，調(diào)節(jié)多種生理和藥理反應(yīng)。交感神經(jīng)系統(tǒng)和兒茶酚胺類物質(zhì)對維持心臟生理功能及血壓穩(wěn)態(tài)具有重要作用[10]。此外，α2-AR與其相連的胞內(nèi)效應(yīng)器調(diào)節(jié)異?？蓪е履承┬难芗膊〉陌l(fā)生，如心力衰竭、心絞痛、心律失常等。

TNF是一個由巨噬細胞分泌多功能促炎細胞因子，其主要通過其受體TNFRSF1A、TNFRSF1B廣泛參與規(guī)定的生物過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TNF是心力衰竭發(fā)生及發(fā)展的重要介質(zhì)，其作用包括抑制心肌收縮功能，促進心肌細胞凋亡，引起心臟重構(gòu)，從而導致心功能失調(diào)與惡化[11]。 因此，芪參顆粒干預(yù)心力衰竭機制可能與使AngⅡ降低，抑制RAS活性、調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)、抑制TNF等炎癥介質(zhì)生物合成等有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測結(jié)果提示其治療心力衰竭的作用靶點可能還包括ATP1A1、AVP、GUCY1B3等，體現(xiàn)中藥復(fù)方多途徑、多靶點協(xié)同作用的特點。

網(wǎng)絡(luò)藥理學為中藥有效成分的篩選及效應(yīng)機制的研究開辟一條高通量途徑，為新藥研發(fā)及機制探討提供新的研究思路。但目前網(wǎng)絡(luò)藥理學仍處于起步發(fā)展階段，其研究手段計算方法及應(yīng)用軟件開發(fā)有待于完善，基于大數(shù)據(jù)和算法構(gòu)建的分子網(wǎng)絡(luò)及藥物靶標網(wǎng)絡(luò)需進一步實驗驗證[12]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理、經(jīng)典藥理相結(jié)合研究路徑研究中藥復(fù)方的藥效靶點，為探索中藥多靶點治療病癥的機制研究提供方法學參考，但其預(yù)測靶點仍需進一步實驗驗證。

表3　芪參顆粒治療心力衰竭對應(yīng)靶點(Top10)

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