鄧家珞，陸利霞，熊曉輝，王　麗

(1. 南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800;2. 昆山市食品質量檢測中心，江蘇 昆山 215300 )

獸藥殘留是動物性食品安全問題中最常見的問題之一[1]。獸藥是指用于預防、治療和診斷動物疾病或者有目的地調節(jié)動物生理機能的物質，其主要包括抗生素、疫苗、殺蟲劑和消毒劑等。動物用藥后，其機體或相關產品肉、蛋、奶內存留的原藥、代謝產物和與獸藥有關的雜質[2-3]即為獸藥殘留。獸藥殘留超標主要是因為養(yǎng)殖人員專業(yè)知識的缺乏或對經濟利益的過度追求，而導致獸藥的違規(guī)使用。動物性食品中的抗生素類(antibiotic)(如，磺胺類、呋喃類等)、抗寄生蟲類(anti-parasitic)和激素類(hormone)藥物等較易引起獸藥殘留量超標。獸藥殘留一方面會導致具有耐藥性菌株的增加，破壞環(huán)境；另一方面，經過食物鏈的傳遞和富集作用，最終會危害到人體健康。

經過多年的努力，我國初步建立了動物性食品獸藥殘留監(jiān)控體系，并取得了巨大進步[4]。目前，常用的獸藥殘留快速檢測技術主要有薄層色譜技術、拉曼光譜技術、免疫技術和生物傳感器技術等，本文中，筆者綜述了常用的快速檢測技術在獸藥殘留檢測方面的成就，對各方法的原理和優(yōu)缺點進行了介紹，并對獸藥殘留問題的解決和快速檢測技術未來發(fā)展方向進行了探討和展望，以期盡可能為后來的研究者們提供必要的幫助。

1　獸藥殘留常用的檢測方法

1.1　表面增強拉曼光譜技術(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)

拉曼光譜是一種散射光譜。拉曼光譜分析法是基于印度科學家C.V.拉曼所發(fā)現的拉曼散射效應，對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉動方面信息，并應用于分子結構研究的一種分析方法。目前，常用的表面增強拉曼光譜分析方法的優(yōu)點在于不需要對樣品進行前處理，也沒有樣品的制備過程，避免了一些誤差的產生，并且在分析過程中操作簡便，測定時間短，克服了常規(guī)拉曼光譜技術靈敏度不高的缺點，可以獲得常規(guī)拉曼光譜得不到的樣品的結構信息。但另一方面，僅有金、銀、銅和堿金屬等少數金屬具有較強的SERS效應，且目前實驗中所觀察到的很多復雜現象尚無法用現有的SERS 理論進行解釋，這都導致表面增強拉曼光譜分析技術投入的應用受到了限制。

Chen等[5]采用簡單靈敏的SERS方法，結合樣品的兩步預處理工藝，對實際奶樣中的青霉素G(PENG)進行檢測，有效地避免了樣品中其他成分的干擾，實現了對PENG殘留物的痕量檢測。結果表明，在最佳檢測條件下，PENG檢測限為2.54×10-9mol/L(相當于0.85 μg/kg)，低于歐盟標準(4 μg/kg)。采用該方法，PENG殘留回收率在76%～97%之間，該方法證明所提出的SERS方法對牛奶中PENG殘留檢測具有可靠性和靈敏性，表明該方法在動物源食品中β-內酰胺類抗生素殘留檢測方面具有極大的潛力。

Zhao等[6]將表面增強拉曼光譜(SERS)與化學計量學方法相結合，實現了豬肉中萊克多巴胺(RAC)和鹽酸克倫特羅(CL)殘留物的快速檢測、識別，總準確率達到100%，并且在0.1～15 mg/L范圍內，回歸曲線線性關系良好(有關該方法的靈敏度，文獻中未說明)，表明SERS是豬肉中RAC和CL殘留快速檢測和鑒定的良好方法。

韓斯琴高娃等[7]構建了新型的SERS檢測平臺，在利用表面增強拉曼光譜(SERS)進行檢測分析時，取得突破性進展，不僅對牛奶樣品中的氨芐西林進行了定性檢測，獲得了檢測限(10-3)，還實現了對加標牛奶樣品中氨芐西林的半定量分析，這是之前的研究者未能實現的。整個檢測過程用時不超過7 min，回收率在95.0%～110.0%，表明該技術在牛奶中獸藥殘留的快速檢測方面具有廣闊的應用前景。

1.2　薄層色譜技術(thin layer chromatography)

薄層色譜法是一種根據混合物中各組分在展開劑中吸附能力的不同，通過反復的吸附、分配，將各種化合物進行分離，從而進一步分析的色譜技術。雖然此法因為操作方便、設備簡單、顯色容易且展開速率快等優(yōu)點，作為快速篩選方法在食品、藥物和化工等領域應用廣泛，但因為該法對生物高分子的分離效果不甚理想，發(fā)展受到了制約。

常規(guī)的薄層色譜法只能顯示化合物的有無，不能反映生物活性。但唐惠玲等[9]將生物自顯影技術與薄層色譜法相結合，既能檢測農產品中殘留抗生素種類，又能評估各類殘留抗生素的毒性，并為未來進行定量檢測奠定了基礎。這種方法成本更低、速度更快，為現場大批量農副產品中殘留抗生素的快速檢測提供了一種經濟、簡便的方法。但由于發(fā)光細菌對被測化合物的極性要求較高，過高或過低都難以形成抑菌點，在具體使用方面有一定的局限性。

Chen等[10]對傳統(tǒng)液相色譜串聯質譜法的難點——牛奶、豬腎和豬肝前處理后，用熒光密度測定法完成對分析物的靈敏度和選擇性定量，然后將高效薄層色譜-噴霧電離/質譜(HPTLC-ESI/MS)聯合使用，直接鑒別目標區(qū)域，有效地減少了潛在的假陽性結果的風險。研究者將薄層色譜與質譜直接耦合，大大擴大了檢測范圍，提高了檢測的靈敏度，可以很容易地應用于常規(guī)篩查。另外，該方法還可以用于定性和定量研究未知物的化學組成，對其進行進一步的分析和更深入的研究。從實際應用的角度來看，直接從HPTLC板快速獲得質譜意味著精力和工作量的大大減少。該方法經過驗證，檢測限和定量限分別為15～40和35～70 μg/kg，具有篩選導向的策略、高通量和成本效益，可以主觀地控制測量的深度，從而節(jié)省大部分合規(guī)樣本的檢測時間和精力。這種面向屏蔽的方法能夠圓滿地解決實踐中可能遇到的問題，因此，對于動物源性樣品(如，牛奶、腎臟和肝臟)中磺胺類藥物殘留物的快速篩選是一個有利的選擇。

1.3　免疫學技術

1.3.1酶聯免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)

酶聯免疫吸附法是采用抗原與抗體的特異性反應，將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，對受檢物質進行定性或定量分析的一種檢測方法。ELISA因為具有操作簡便、特異性強、靈敏度高、適用于現場檢測等優(yōu)點，被廣泛應用于食品和醫(yī)學檢測領域。

Li等[11]在使用基于IgY抗體的間接競爭性酶聯免疫吸附測定法(ic-ELISA)檢測動物性食品中的卡那霉素和慶大霉素殘基時發(fā)現， ic-ELISA的檢測限均為0.001 μg/mL，明顯優(yōu)于熒光偏振免疫法(FPIA)的0.17和0.007 μg/mL，表明ic-ELISA可能比FPIA更適合用于抗生素殘留檢測。

楊熠等[12]基于卵黃抗體率先建立了檢測恩諾沙星的ic-ELISA方法，確定該方法的靈敏度值和檢測限(LOD)分別為18.207與4.323 ng/mL，檢測范圍為7.350～45.102 ng/mL，與其他研究相比，該方法較為靈敏、易操作，檢測范圍也相對適宜。

Liang等[13]開發(fā)了用于奧硝唑(ONZ)檢測的單克隆抗體(mAb)和間接競爭性酶聯免疫吸附測定(ic-ELISA)方法，該方法中ONZ的50%抑制濃度、檢測限和質量限分別為0.15、0.01和0.05 μg/kg，結果顯示，基于mAb的ic-ELISA可用于ONZ的快速檢測，且與液相色譜等儀器檢測方法相比，在滿足食品中殘留檢測準確性要求的同時，其操作更簡單，費用更低。

1.3.2免疫層析技術(immunochromatography)

免疫層析技術是建立在抗原-抗體特異性免疫反應和層析技術之上的新興免疫檢測技術，其檢測原理為：待測物在毛細管作用下，向抗體所在區(qū)域移動，當二者結合時，會發(fā)生特異性免疫反應。目前，常用的免疫層析技術主要有熒光免疫膠體金技術、量子點熒光免疫層析技術和熒光微球免疫層析技術等。

拜錦美等[15]在加標的豬肉、雞肉和魚肉樣品中加入甲醇和磷酸鹽吐溫(PBST)緩沖液，檢測制得的濾液稀釋液中磺胺類藥物殘留量，結果視覺檢測限度為0.01 mg/kg,檢測用時在10 min以內，顯示出膠體金免疫層析法較高的靈敏性和特異性。由于該方法制備的試紙保存時間較久，操作容易，可以直接通過目測診斷，能作為一種簡便的現場檢測技術進行推廣。

彭娟[16]基于單克隆抗體3E4和單克隆抗體1A11，分別建立了膠體金層析試紙條，并對加標牛奶通過比色法得到32種喹諾酮類藥物的檢測限和消線值，其檢測限為0.25～10 mg/mL，消線值為1～100 mg/mL，之后的交叉實驗證明該方法對喹諾酮類藥物具有高度的特異性，適用于現場快速檢測牛奶中喹諾酮類藥物殘留。

目前關于免疫層析法的研究熱點，除了新型膠體金技術，主要在于以量子點為標記物的量子點熒光免疫層析技術和以熒光微球為標記物的熒光微球免疫層析技術等。

Tao等[17]建立了基于量子點(QDs)的新型雙標記直接競爭熒光免疫法(DC-FLISA)，采用分別被QD520和QD635(520和635 nm分別為抗卡巴多克代謝物抗體和抗喹乙醇代謝物抗體的最大發(fā)射波長)標記的抗卡巴多克代謝物單克隆抗體和抗喹乙醇代謝物多克隆抗體，同時測定動物組織中卡巴多克代謝物QCA和喹乙醇代謝物MQCA。測定QCA和MQCA的檢測限分別為0.05和0.07 ng/mL，回收率為81.5%～98.2%(QCA)和84.2%～95.7%(MQCA)。該結果的可靠性通過高效液相色譜(HPLC)確認，證明DC-FLISA是一種靈敏度高、特異性好、簡單快速、成本低廉、回收率良好且適用于大量樣品的快速鑒定和定量方法。

Li等[19]通過多殘留熒光微球免疫層析法(FMCA)對生乳中的紅霉素(ERY)、螺旋霉素(SPI)、替米考星(TIM)和泰樂菌素(TYL)同時進行檢測，結果半抑制濃度IC50值分別為1.36、1.22、1.01和1.39 ng/mL，檢測限(LOD)為0.13 ng/mL，回收率范圍分別為91.8%～109.2%、89.6%～114.4%、84.8%～111.6%和85.8%～115.2 %。該方法大大簡化了操作步驟，整個測試過程在20 min內完成，節(jié)省了大量時間。與免疫金層析法(IGCA)相比，FMCA更敏感，更穩(wěn)定，抗體消耗更少。該方法可靠性通過液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)驗證，FMCA可廣泛應用于其他抗生素或其他污染物的檢測。

Wang等[20]基于熒光微球免疫層析法開發(fā)的免疫層析試紙條，將包被抗原和羊抗鼠IgG分別作為檢測限和質檢限，對牛奶中的泰樂菌素殘留進行檢測。結果表明，在最佳條件下，該方法檢測限為25 μg/L，檢測時間短于25 min，該方法簡便快速、特異性良好、無需樣品前處理，適合于基層奶站和現場快速篩選。

1.4　生物傳感技術(biosensor technology)

生物傳感技術是以生物活性單元(如，酶、抗體、核酸或細胞等)作為生物敏感單元，對目標物具有高度選擇性的分析技術，該法具有專一性強、分析速度快、準確率高、操作簡單及成本低等特點?？捎糜诜治鲋饕ㄊ称烦煞?、食品添加劑、有害毒物及食品鮮度等指標的測定。以抗生素為例，其篩選的典型方法是微生物生長抑制和免疫學分析，但這兩種方法存在靈敏度差、缺乏特異性等缺點，因此有必要開發(fā)簡便、高效、高靈敏度的抗生素殘留篩選方法。生物傳感器是新興的篩選動物制品中的抗生素殘留物方法，已經廣泛使用的2種類型的生物傳感器分別是基于全細胞的生物傳感器和基于表面等離子體共振的傳感器。它們的優(yōu)勢是便攜，樣品需求量小，靈敏度高且特異性好[21]。

袁愛夢等[22]設計了一種新型的檢測動物源食品中卡那霉素的金納米級比色傳感器，檢測限可達30 nmol/L，對加標豬肉樣品中的卡那霉素回收率可以達到98.27%～104.31% ，不僅對卡那霉素具有極強的特異性，而且操作簡單快速，易于普及，適于現場快速檢測，具有很強的實用性。

Yan等[23]利用絕緣硅基底上二維氣孔形成的光子晶體(PC)微腔作為生物傳感器，成功檢測到分子量僅為478 g/mol的慶大霉素；又通過將不同類型的PC生物傳感器結合在單個硅芯片上，檢測范圍(濃度)為0.1 nmol/L～1 μmol/L，并且在驗證實驗中，表現出良好的特異性。另外，該傳感器通過與微流體等結合，可以實現實時高通量傳感測試，適用于慶大霉素的現場快速檢測。

Duyen等[24]基于β-半乳糖苷酶誘導的顏色變化，開發(fā)了一個檢測巴龍霉素、四環(huán)素、氯霉素和紅霉素等抗生素的比色紙基生物傳感器，檢測限分別為0.5、2.1、0.8和6.1 μg/mL，其成本低廉，易于運輸、處理且在室溫下能保持變色至少50 d，可在實際水樣的pH范圍內使用。該方法也不會對自然環(huán)境造成危險，適合實際環(huán)境中水樣的現場快速檢測。

1.5　生物芯片技術(biochip technology)

生物芯片技術起源于核酸分子雜交。所謂生物芯片一般指高密度固定在互相支持介質上的生物信息分子(如，基因片段、DNA片段或多肽、蛋白質、糖分子或胞內組織等)的微陣列雜交型芯片。生物芯片是根據生物分子間特異相互作用的原理，實現對DNA、RNA、多肽、蛋白質以及其他生物成分的高通量快速檢測的。在現代營養(yǎng)學、食品毒理學、食品微生物領域和轉基因食品檢測中有大量的應用。

Gaudin等[25]基于多陣列生物芯片技術檢測不同動物肌肉以及水產養(yǎng)殖產品中喹諾酮類、頭孢噻呋、甲砜霉素、鏈霉素、泰樂菌素和四環(huán)素等6種抗生素的殘留，假陽性率為0。對恩諾沙星等12種抗生素的檢測能力均低于最大殘留限量(MRL)(200 μg/kg)，且特異性良好。之后，Gaudin等[26]基于該方法評估、驗證了微生物學試劑盒(Explorer?2.0)和免疫生物傳感器試劑盒(AM?II)在檢測雞蛋中的抗生素殘留方面的效果，結果表明效果良好，二者都能靈敏檢測到目標抗生素殘留，但前者檢測限較高，部分可達1.5MRL，而后者不僅能同時檢測出多種混合抗生素，而且檢測限最高為鏈霉素的100 μg/kg，均低于MRL。但Explorer?2.0若與電子閱讀器相結合，可以成為現場應用(如，屠宰場、農場)的重要工具，這是因為試劑盒與電子閱讀器兩者結合后，易于操作和自動閱讀。

Ha等[27]將環(huán)丙沙星特異性抗體固定在表面修飾的芯片上，開發(fā)了一種簡便快速的方法來檢測環(huán)丙沙星殘留物。表面改性的微粒和生物芯片結合的方法在標準溶液中的檢測限和定量限分別為1和20 μg/kg，比目前使用的高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳(CE)和酶聯免疫吸附(ELISA)等技術更靈敏地檢測到環(huán)丙沙星。雖然回收率不高，達不到定量檢測，但是不需要熟練的技術人員和復雜的純化處理，能夠以低成本實現簡單而連續(xù)的檢測，從而能夠以高通量的方式高靈敏度地連續(xù)監(jiān)測大量食品中痕量抗生素的含量。

Li等[28]發(fā)明的可視化生物薄片用于檢測各種抗生素時，與現有技術相比，比理化檢測方法成本低，操作簡單，比免疫分析方法測定的靶標多，比微生物檢測方法檢測時間短。另外，該發(fā)明提供的芯片對牛奶中氯霉素等抗生素物質的檢出限最低可達0.05 ng/mL，靈敏度較高，回收率為80%～120%，特異性好，適合現場對樣品進行大規(guī)模的初步篩選。

1.6　近紅外光譜技術(near infrared spectroscopy,NIS)

近紅外光譜是指波長介于可見光和中紅外光之間的近紅外光的光譜，其根據不同基團的吸收波長和強度的不同，通過與分析模型的對比，從而獲得待測物的結構信息。因此，在新技術的開拓方面，作為一種廣泛應用于果蔬、肉制品、乳制品和釀造食品等方面的無損檢測技術，近紅外光譜的潛力有待發(fā)掘。與其他分析檢測技術相比，近紅外光譜分析技術不僅速度快、效率高，而且環(huán)保無公害，易于實現在線檢測[29]。目前來看，因為獸藥殘留在動物性食品中含量較低，導致近紅外區(qū)域的信息受背景噪聲干擾，難以提取和利用，因而限制了該技術在獸藥殘留檢測方面的發(fā)展。但是，Lê等[30]將近紅外光譜與化學計量分析相結合，定性定量分析了青霉素、阿莫西林和阿莫西林/克拉維酸3種抗生素，鑒別效果良好，定量分析符合相對誤差。楊增玲等[31]通過傅里葉變換近紅外顯微成像系統(tǒng)對豆粕和3種抗生素菌渣進行鑒別分析，結果發(fā)現抗生素菌渣樣品鑒別的正確率在99.4%以上。所以，隨著技術的發(fā)展，近紅外光譜技術的靈敏度將會得到提高，未來會有希望應用到獸藥殘留檢測方面。

2　不同檢測方法的比較

在上述的諸多獸藥殘留檢測方法中，薄層色譜法不僅預處理復雜，而且操作繁瑣，成本高昂，對人員素質的要求較高，不適合現場的大規(guī)?？焖贆z測[32]。膠體金免疫技術檢測限較高，易出現假陰性或假陽性[33]。目前較為成熟的檢測技術是ELISA，該法不僅操作簡便、特異性強，而且靈敏度高、適用于現場檢測，被廣泛應用于食品、醫(yī)學檢測等領域[34]。但現有的ELISA不能同時測定多個靶點。如果需要確定樣本中的各種抗生素，則需要對每個抗生素進行測試，會消耗更多的時間和材料[35]。

拉曼光譜技術既無需預處理，也無樣品制備過程，因而避免了誤差的產生，更因為其無損檢測的優(yōu)點，是一種良好的現場檢測技術，具備一定的發(fā)展?jié)摿36]。生物傳感器技術雖然起步較晚，但在農獸藥殘留測定領域發(fā)展較快，目前在篩選高親和力的適配體上仍然受到技術限制，但總體來說，仍然具有較好的發(fā)展前景[37]。而生物芯片技術也因其通量高、特異性強和靈敏快速等特點，在獸藥殘留的檢測領域得到越來越多研究者的關注[38]。

3　發(fā)展趨勢

民以食為天，隨著獸藥殘留檢測技術的不斷進步，社會必將對相關研究者提出更高的要求，發(fā)展靈敏度更高、操作性更好的獸藥殘留檢測技術已迫在眉睫。目前，國內外的獸藥殘留檢測技術正向微量、快速、便捷和高通量等方向發(fā)展[39]，未來的獸藥殘留快速檢測技術必將是多維而全面的。例如，將多種現有的檢測技術進行聯用，從而達到多組分同時、高效檢測的目的。但這還需要克服一些困難，因為殘留分析傳統(tǒng)上是低通量技術，而多種方法的聯用將導致越來越多的樣本需要多級傳遞，從而導致成本的增加[40]。另一方面，獸藥殘留檢測技術中，也將會應用到更多的新技術，未來的發(fā)展方向將會集中在納米技術的應用、多通路自動化檢測方案的實現和換能檢測方法的創(chuàng)新與改進等方面。如拉曼光譜和傳感器將會更加緊密地與納米技術結合起來，從而獲得更加靈敏的檢測效果。

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