周　凱，唐冰娥，徐振林，劉　占，孫遠(yuǎn)明，陳　穗

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2. 廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528000)

氨基甲酸乙酯(EC)，又稱尿烷，在水和醇類溶劑中溶解性良好，化學(xué)工業(yè)上有多種用途[1]，還曾經(jīng)用于麻醉[2]和腫瘤治療[3]。然而，自從1943年EC被發(fā)現(xiàn)具有潛在的致癌性開始[4]，眾多有關(guān)其危害的研究陸續(xù)展開，在1974年EC被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為2B級(jí)致癌物(人類可能致癌物)。此后，有證據(jù)顯示EC能夠直接導(dǎo)致人類產(chǎn)生肝癌[5]，在2007年,EC致癌等級(jí)被提升至2A級(jí)。從食品中攝入的EC，除了大部分被水解和少部分直接排出之外,其致癌性主要由EC被線粒體中的細(xì)胞色素P450通過N-羥基化和側(cè)鏈氧化形成N-羥基-氨基甲酸乙酯和乙烯基-氨基甲酸乙酯導(dǎo)致的。2005年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)對(duì)EC攝入進(jìn)行安全評(píng)估，認(rèn)為日常飲食中攝入的EC為15 ng/(kg·bw·d)，低于基準(zhǔn)攝入量下限0.3 mg/(kg·bw·d)，但該評(píng)估結(jié)果不包括酒精飲料，因此評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)較低。但Schlatte等[6]認(rèn)為，假定人一生患癌風(fēng)險(xiǎn)為10-6，攝入EC含量在20～80 ng/(kg·bw·d)是安全的，以此計(jì)算，人類暴露EC中風(fēng)險(xiǎn)依然較高，尤其是在飲酒人群中[7-8]。目前，針對(duì)食品中EC的研究主要集中在致癌風(fēng)險(xiǎn)、含量檢測(cè)、形成原因和控制方法4個(gè)方面(圖1)。

圖1　　　　發(fā)酵食品中EC的主要研究?jī)?nèi)容Fig.1　　　　Recent researches on EC in fermentation foods

1　發(fā)酵食品中EC含量

EC是發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中自發(fā)產(chǎn)生的一種有害物，在酒類、醬油、豆瓣醬和泡菜等發(fā)酵酒類和食品中均有檢出[9-11]，甚至在一些面包和香煙中也有檢出[12]。表1為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道的一些發(fā)酵食品中EC的污染情況。從表1中可以看出，除了啤酒以外，酒類中EC含量普遍高于其他發(fā)酵食品，國(guó)內(nèi)黃酒和米酒中EC含量要顯著高于其他酒類。而在其他國(guó)家，蒸餾酒和烈酒中EC含量更高。參考世界各國(guó)對(duì)酒中EC標(biāo)準(zhǔn)限量的最嚴(yán)格值(葡萄酒15 μg/L，白蘭地1 000 μg/L，蒸餾酒150 μg/L，烈酒60 μg/L，清酒200 μg/L)，依然有大量酒類中EC含量超標(biāo)。此外，在非酒類食品中，醬油和紅腐乳中EC含量要顯著高于其他食品，鑒于部分亞洲國(guó)家生產(chǎn)和食用醬油量較大[13]，醬油在某些人群中可能成為日常攝入EC的主要食物[14]，值得關(guān)注。

2　發(fā)酵食品中EC主要形成原因和控制方法

目前針對(duì)發(fā)酵食品中EC的形成已經(jīng)有了較為確定的描述，主要認(rèn)為由乙醇和氨甲酰化合物發(fā)生醇解反應(yīng)生成，發(fā)酵食品中的氨甲?；衔镏饕心蛩?、瓜氨酸、氨甲酰磷酸和焦碳酸二乙酯等。此外，氰化物經(jīng)過發(fā)酵轉(zhuǎn)變成氰酸也能與乙醇反應(yīng)形成EC，而影響EC形成的環(huán)境因素主要有溫度、催化劑、pH、光照和貯藏時(shí)間。由于焦碳酸二乙酯主要由外源添加，已有證據(jù)顯示其與酒精能反應(yīng)形成EC[15]，目前在葡萄酒釀造過程中已基本不再使用。氨甲酰磷酸主要通過酵母中氨甲酰磷酸合酶和細(xì)菌精氨酸脫亞氨基途徑產(chǎn)生，一般不被釋放到細(xì)胞外，因此大多數(shù)情況下被忽略。

2.1　前體物質(zhì)

乙醇是EC形成的主要前體物質(zhì)之一，所有的氨甲?；衔镏挥性谝掖即嬖谙虏拍苻D(zhuǎn)化成EC。在大多數(shù)EC含量高的酒類中，酒精度數(shù)一般高于8%，有些能夠達(dá)到60%甚至更高，因此，在這些發(fā)酵食品中，乙醇不再是EC形成的制約因素。而另一些發(fā)酵食品，如醬油、豆瓣醬和面包等，乙醇只是發(fā)酵副產(chǎn)物，一般含量在2%以下，而其他前體物質(zhì)如瓜氨酸能達(dá)到2 000 mg/L、尿素約為50 mg/L，此時(shí)乙醇成為EC最重要的前體[15]，在高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中，酒精與EC含量成顯著正相關(guān)[27]。此外，在氨基甲酸乙酯的合成中也明確發(fā)現(xiàn)，乙醇和尿素的配比隨著濃度的提高而增大，同時(shí)也逐漸變緩[28]。然而在發(fā)酵食品中，乙醇要么是酒類飲料的主要成分，要么對(duì)發(fā)酵食品風(fēng)味有強(qiáng)烈影響，難以通過降低乙醇含量來(lái)達(dá)到降低EC的目的。

尿素是大部分發(fā)酵酒類中最主要的前體物質(zhì)[29-30]，也是被研究最為深入和透徹的影響因素之一。一定濃度的尿素和發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇在偏酸性條件下反應(yīng)生成EC，尿素主要來(lái)源于釀酒酵母的尿

表1　各種發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量調(diào)查

注：“-”表示文獻(xiàn)未涉及，“ND”表示含量在檢測(cè)限以下。

素循環(huán)和原料，部分尿素在無(wú)偏好型氮源存在下被水解利用，但在氮阻遏效應(yīng)調(diào)控下，尿素水解酶表達(dá)受到抑制，從而造成尿素的積累，通過主動(dòng)運(yùn)輸釋放到細(xì)胞外。降低尿素含量的方法主要有3種。①通過定向選育、誘變育種或雜交育種等方式篩選低產(chǎn)尿素的釀酒酵母[31-32]。②通過基因工程手段定向改造現(xiàn)有釀酒酵母，主要分為兩類：一類是直接通過改造尿素代謝和運(yùn)輸相關(guān)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，如將編碼精氨酸酶的CAR1基因敲除，從而切斷精氨酸轉(zhuǎn)化成鳥氨酸和尿素[33-35]，但該方法容易造成原料精氨酸浪費(fèi)，又或者過表達(dá)尿酰胺酶編碼基因DUR1,2[36]和尿素運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白編碼基因DUR3[37]，從而加速尿素分解或?qū)h(huán)境中的尿素吸收，但兩者共同實(shí)施并未顯示協(xié)同效果[38](圖2(a))；另一類是通過代謝調(diào)控影響尿素代謝相關(guān)基因表達(dá)，此類調(diào)控因子較多，趙鑫悅[29]將磷酸化調(diào)控因子Gln3p和Gat1p共表達(dá)的基因工程菌株釀酒酵母N85應(yīng)用于黃酒發(fā)酵，尿素含量降低了63%，且發(fā)酵特性變化很小。③直接向發(fā)酵液中添加酸性脲酶以降低尿素含量[9,39]。

瓜氨酸被證明是某些酒類[40-41]和醬油[27]的主要前體之一，發(fā)酵液中含量可達(dá)2 000 mg/L。瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，發(fā)酵液中的乳酸菌能夠通過精氨酸脫亞氨基途徑(ADI)將精氨酸轉(zhuǎn)變成瓜氨酸，并通過主動(dòng)運(yùn)輸釋放到環(huán)境中。有研究證實(shí)，環(huán)境因素(pH、鹽脅迫等)是導(dǎo)致乳酸菌arcA和arcB轉(zhuǎn)錄水平不等比例下降、從而導(dǎo)致瓜氨酸積累的主要原因[42](圖2(b))，而瓜氨酸的釋放與菌株的細(xì)胞通透性變化緊密相關(guān)[30]，然而細(xì)胞通透性變化導(dǎo)致的精氨酸和鳥氨酸的變化，這種區(qū)別并未給予充分說(shuō)明。目前，篩選瓜氨酸利用菌株并接種至發(fā)酵液中是降低瓜氨酸含量最有效的方法，但對(duì)于如何干擾高產(chǎn)瓜氨酸的魏斯氏菌和葡萄球菌等積累瓜氨酸，并未過多探討。

圖2　　　　兩種代謝工程技術(shù)抑制尿素積累(a) [30] 和鹽脅迫對(duì)乳酸片球菌ADI途徑的調(diào)節(jié)(b)[15]Fig.2　　　　Schematic diagram of two metabolic engineering technologies for eliminating urea(a) and proposed NaCl effect on ADI pathway regulations(b)

氰化物是果酒[43-44]和蒸餾酒[21]中最主要的前體物質(zhì)，目前已經(jīng)證實(shí)與酒精反應(yīng)生成EC的氰化物主要是異氰酸，而且該反應(yīng)速率常數(shù)與乙醇和氰化物濃度無(wú)關(guān)，隨著溫度的升高而增加，隨著pH的升高而降低[44]。異氰酸主要由發(fā)酵原料中的生氰糖苷水解生成的氰酸異構(gòu)化產(chǎn)生，受環(huán)境pH和溫度影響最大。由于氰酸和EC沸點(diǎn)差異，在蒸餾過程中可通過“掐頭去尾”的方式將大部分氰酸和生成的EC去除。

2.2　環(huán)境因素

溫度幾乎是所有前體物質(zhì)反應(yīng)形成EC最重要的影響因素。不同發(fā)酵溫度[43]、滅菌溫度[45]和蒸餾溫度[21]均與EC含量成顯著正相關(guān)，在預(yù)測(cè)EC生成模型中，需要區(qū)分不同的加工貯藏溫度[46]。醇解反應(yīng)需要在偏酸性pH條件下形成，但是由于同類食品中pH變化較小，故對(duì)EC形成影響較小，目前研究較少。值得注意的是，前體之一的氰化物形成需要經(jīng)過水解等步驟轉(zhuǎn)化才能與乙醇反應(yīng)，這個(gè)過程中，氧氣和金屬離子催化劑對(duì)EC含量影響很大[47-48]，尤其是Cu2+，與氰酸形成的中間體更容易與乙醇反應(yīng)形成EC。因此，在氰酸為主要EC前體物質(zhì)的果酒蒸餾酒中，選擇合適的蒸餾器皿是降低EC的有效方法，而在尿素與乙醇反應(yīng)中，ZnCl2的影響更大[28]。在食品發(fā)酵過程中，金屬離子濃度變化不大[27]，故對(duì)EC形成的影響有限。此外，某些抗氧化劑比如焦亞硫酸鉀的添加能夠降低EC含量，但實(shí)際效果有限[47]，從化學(xué)反應(yīng)角度來(lái)說(shuō)，多羥基的酚類抗氧化劑能夠與乙醇競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生醇解反應(yīng)，從而降低EC含量?？偟膩?lái)說(shuō)，降低加工溫度、O2含量、金屬離子催化劑以及適當(dāng)?shù)膒H能夠控制發(fā)酵食品中EC含量。直接添加EC降解酶[49]或者利用吸附材料[50]除去EC也是可取的方法，但是存在降解酶不耐酸和酒精、吸附材料對(duì)風(fēng)味有影響且效率低等問題。

3　檢測(cè)方法

由于發(fā)酵食品中EC含量較低且基質(zhì)干擾較多，合適的檢測(cè)方法對(duì)于評(píng)估和控制EC的污染水平十分必要。對(duì)于檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，靈敏度、可靠性和精密度需要嚴(yán)格考量，甚至在某些時(shí)候檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)性和操作的方便性也是選擇的重要依據(jù)。

3.1　色譜檢測(cè)

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)是檢測(cè)EC的主要方法，也是許多組織機(jī)構(gòu)和政府部門設(shè)立的檢測(cè)方法。使用d5-EC作為內(nèi)標(biāo)，樣品經(jīng)過處理后通過GC-MS測(cè)定在各種食品和不同實(shí)驗(yàn)室中均呈現(xiàn)良好的重復(fù)性和回收率[19，51]，由于不同食品雜質(zhì)干擾不同，導(dǎo)致前處理各異，不同樣品之間檢測(cè)限差異較大，基本在1～20 μg/L之間，回收率為90%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于15%(表2)，可靠性良好。為了降低檢測(cè)限，更好地排除基質(zhì)干擾，分辨特征離子，三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法(GC-MS/MS)能夠更好地用于低含量EC的檢測(cè)[20]，液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS/MS)方法能夠大幅縮短檢測(cè)所需時(shí)間并避開氣相色譜需要嚴(yán)格限制水分的要求，檢出限更低的同時(shí)，能夠保證良好的穩(wěn)定性，最低檢測(cè)時(shí)間可在6 min之內(nèi)，但對(duì)于不同檢測(cè)對(duì)象，離子化方式(ESI和APCI)上選擇不同[12,22]。Deák等[52]選擇在檢測(cè)之前用9-占噸醇將EC衍生，發(fā)現(xiàn)電離后更傾向于生成[M+Na]+，更容易定量且穩(wěn)定性良好，但顯著延長(zhǎng)了前處理時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間。雖然基本上所有的色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)都能夠很好地分離EC并精確定量，然而對(duì)于大部分發(fā)酵食品生產(chǎn)的中小企業(yè)和基層檢測(cè)單位來(lái)說(shuō)，即使具備這些大型檢測(cè)儀器也缺乏相應(yīng)操作人才。而液相色譜的應(yīng)用則非常普及，采用高效液相色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD)檢測(cè)EC，進(jìn)樣前在酸性條件下與9-占噸醇衍生，通過優(yōu)化衍生條件、激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)、流動(dòng)相在某些樣品中檢測(cè)限甚至能低于5 μg/kg。然而，這種方法還具有一些缺陷：首先對(duì)于酒精含量較高的酒類，乙醇會(huì)干擾衍生反應(yīng)，甚至在衍生時(shí)進(jìn)一步形成EC造成誤差，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，間接提高了定量限。其次，在一些顏色較深的發(fā)酵食品如腐乳和醬油中，衍生前需要添加一步除雜和富集的步驟，直接延長(zhǎng)了每個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間(目前至少需要60 min)[21]。此外，由于衍生劑9-占噸醇與EC的反應(yīng)是一個(gè)酸性條件的可逆反應(yīng)，衍生后到檢測(cè)這段時(shí)間也會(huì)對(duì)結(jié)果有影響，衍生產(chǎn)物在230 nm激發(fā)波長(zhǎng)下有兩個(gè)顯著的發(fā)射波長(zhǎng)，308和600 nm，不同樣品的干擾效應(yīng)不同，需要確定不同的發(fā)射波長(zhǎng)[27]。

目前，采用儀器方法檢測(cè)EC的報(bào)道已經(jīng)屢見不鮮，綜述報(bào)道也不少[31,53]，但是由于EC分子量太低且分子特征不顯著，對(duì)EC的快速檢測(cè)方法缺乏系統(tǒng)和深入的分析。目前即將出臺(tái)的黃酒中EC限量、EC快速篩查方法的推廣，前景廣闊。

3.2　快速檢測(cè)

3.2.1酶法

有機(jī)磷和一些帶苯環(huán)或雜環(huán)氨基甲酸酯類農(nóng)藥能夠抑制乙酰膽堿酯酶的水解作用，因此，目前常用酶抑制法對(duì)這一類物質(zhì)進(jìn)行快速檢測(cè)。EC分子也具有氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)，但其分子特征不顯著，對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用不明顯，通過加入一些增敏試劑，如3%的溴水-NaOH溶液，能夠顯著提高EC的抑制作用，在緩沖溶液中對(duì)EC的檢出限可低至41.77 μg/L[54]。酒類中乙醇本身對(duì)乙酰膽堿酯酶就具有強(qiáng)烈的抑制作用，采用溶劑萃取等前處理方法對(duì)酒中EC提取和凈化，乙酸乙酯的殘留也會(huì)抑制酶活，故不適用于EC的實(shí)際樣品檢測(cè)，但為此提供了一個(gè)思路：如果采用某種方式對(duì)EC分子進(jìn)行改造，通過衍生的方法使得衍生產(chǎn)物能夠增強(qiáng)對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制效果，能夠大大提高檢測(cè)靈敏度和精密性。

酶法檢測(cè)目標(biāo)分子的另一個(gè)思路是：采用水解酶將目標(biāo)分子水解后，通過檢測(cè)產(chǎn)物從而定量目標(biāo)物，在與EC密切相關(guān)的精氨酸檢測(cè)中有應(yīng)用先例[55]。目前，國(guó)內(nèi)外篩選出來(lái)的EC降解酶已經(jīng)有數(shù)十種，部分降解酶對(duì)乙醇的耐受度可達(dá)20%，仍具有50%以上的酶活力[49]，但是只有具備能夠水解EC酰胺鍵生成NH3分子，且需要足夠靈敏度的方法檢測(cè)水解后的氨分子的量才能進(jìn)行精確定量。盧曉霞[56]通過構(gòu)建雙酶體系的電化學(xué)傳感器對(duì)模擬黃酒中EC進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限低至5.26 nmol/L，精密度和穩(wěn)定性良好(圖3)。該方法只需在檢測(cè)前構(gòu)建傳感器，并不需要對(duì)樣品進(jìn)行處理。不過目前電化學(xué)傳感器還未廣泛用于實(shí)際樣品檢測(cè)，且酶的特異性(對(duì)尿素和氨基甲酸酯的同系物也有部分降解作用)也有待深入探討。

圖3　　　　雙酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)EC的原理[56]Fig.3　　　　Schematic illustration of EC determination

3.2.2薄層色譜法

薄層色譜法是一種不需要借助儀器手段可以對(duì)樣品進(jìn)行分離和定性甚至定量的色譜分析技術(shù)。主要步驟包括展開劑的選擇、點(diǎn)樣、展開、顯色和分析，通常包括計(jì)算比移值(Rf)和確定斑點(diǎn)顏色深淺。目前由于成像系統(tǒng)的改善并引入先進(jìn)的數(shù)字處理技術(shù)，對(duì)EC的檢測(cè)限甚至能達(dá)到mg/L甚至是μg/L級(jí)別。Jaryj等[57]首先采用該方法分離烈酒中的EC，隨后在酸性環(huán)境下使分離的EC與肉桂醛在高溫下反應(yīng)，測(cè)定熒光范圍為445～460 nm，該方法定量范圍為320 μg/L～8.1 mg/L。王浩[58]采用同樣的方法，通過簡(jiǎn)化成像系統(tǒng)和優(yōu)化分離條件運(yùn)用于多種酒類檢測(cè)中，但是該方法回收率過低、檢測(cè)限過高，基本只能用于EC含量超過1 mg/L的酒類檢測(cè)，且通過簡(jiǎn)單的氮吹濃縮后，由于糖類等黏性物質(zhì)的存在，該方法不再適用，而通過前處理凈化濃縮，也大大延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間。

3.2.3光譜法

3.2.4免疫檢測(cè)法

圖4　　　　EC間接免疫檢測(cè)方法示意圖(a)[63]和基于熒光硅納米顆粒的增敏方法原理圖(b)[64]Fig.4　　　　Schematic illustration of an indirection ELISA(a) and fluorescent silicon nanoparticles-based ratiometric fluorescence immunoassay(b) for EC sensitive detection

目前，幾乎所有的EC快速檢測(cè)方法均存在干擾因素較多、檢測(cè)限過高、穩(wěn)定性較低的特點(diǎn)，尚未應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)，而儀器分析方法也需要排除各種干擾因素，因此樣品前處理在目前的檢測(cè)條件下依然必不可少。

3.3　色譜儀器分析檢測(cè)和快速檢測(cè)的比較

色譜儀器檢測(cè)方法和快速檢測(cè)方法對(duì)發(fā)酵食品中EC含量檢測(cè)的比較如表2所示。通過對(duì)比儀器檢測(cè)方法和快速檢測(cè)方法在靈敏度、重復(fù)性、易用性以及價(jià)格和時(shí)間上的花費(fèi)，以決定在不同的食品種類和檢測(cè)情形中采用何種檢測(cè)方法。

一般需要考察以下幾個(gè)方面：①根據(jù)各國(guó)對(duì)食品中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)以及發(fā)酵食品中EC的含量，對(duì)葡萄酒、醬油、醋和腐乳中EC的分析方法的定量限應(yīng)該低于10 μg/kg，對(duì)黃酒、蒸餾酒和白蘭地等酒類來(lái)說(shuō)，方法的定量限應(yīng)低于100 μg/kg。而GC-MS和HPLC-MS/MS等分析方法的定量限一般在1～10 μg/kg之間，能充分滿足各種發(fā)酵食品中EC的檢測(cè)要求，有針對(duì)性地優(yōu)化后的HPLC-FLD也能滿足絕大多數(shù)的檢測(cè)場(chǎng)景。對(duì)于快速檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，SERS檢測(cè)和衍生后的免疫檢測(cè)能基本滿足黃酒和白蘭地等限量要求較高的酒類。在

表2　色譜儀器檢測(cè)方法和快速檢測(cè)方法對(duì)發(fā)酵食品中EC含量檢測(cè)的應(yīng)用

注：a表示未提及；b表示根據(jù)不同的香煙和干濕狀態(tài)，c表示85%～91%的校正集，而77%～85%為驗(yàn)證集。

沒有富集步驟的前提下，直接免疫檢測(cè)和酶法檢測(cè)基本不能滿足檢測(cè)要求。這是限制目前快速檢測(cè)EC方法的最重要因素。②大部分的色譜儀器檢測(cè)方法能夠檢測(cè)絕大多數(shù)發(fā)酵食品，適用于絕大多數(shù)使用場(chǎng)景，且回收率基本在80%～120%之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%，甚至有些低于5%。而大部分EC快速檢測(cè)方法缺乏足夠的數(shù)據(jù)，需要進(jìn)一步評(píng)估，免疫檢測(cè)和薄層色譜法只針對(duì)一種酒類的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差就接近于10%，這是確保EC檢測(cè)方法用于實(shí)際檢測(cè)場(chǎng)景急需克服的難題。③一般而言，色譜儀器檢測(cè)方法需要經(jīng)過SPE凈化后上樣檢測(cè)，或者經(jīng)過衍生以確保方法的高靈敏性，但是大部分快速檢測(cè)方法不需要富集和純化步驟，平均一個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間均低于20 min，且花費(fèi)更少。在目前條件下，很難做到不對(duì)樣品進(jìn)行任何處理的實(shí)時(shí)在線檢測(cè)。發(fā)展EC快速檢測(cè)方法，對(duì)于監(jiān)測(cè)發(fā)酵食品中EC含量有重要意義，同時(shí)有助于了解生產(chǎn)過程中的EC含量檢測(cè)，便于更好地控制發(fā)酵食品中EC水平。

4　結(jié)論與展望

目前，隨著對(duì)發(fā)酵食品中EC形成機(jī)理更深入的了解，提出了越來(lái)越多的EC含量控制方法，然而能夠用于實(shí)際生產(chǎn)的措施依然很少，酒中的EC含量高于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此，應(yīng)該綜合考慮不同發(fā)酵食品中主要的EC前體物質(zhì)與環(huán)境因素對(duì)EC形成的影響，在研究控制EC含量方法時(shí)與實(shí)際生產(chǎn)過程緊密結(jié)合，并進(jìn)行驗(yàn)證。利用基因工程方法改造初始發(fā)酵菌株如敲除釀酒酵母中編碼精氨酸酶的CAR1基因需要慎重考慮，而調(diào)控酵母的氮代謝途徑從而降低尿素積累的方法還應(yīng)在實(shí)際發(fā)酵環(huán)境中作進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，在發(fā)酵食品分離能夠大量消耗EC前體物質(zhì)又不顯著改變發(fā)酵風(fēng)味的菌株應(yīng)用于同種發(fā)酵食品中[69]，對(duì)于降低該發(fā)酵食品中EC含量應(yīng)用前景廣闊，調(diào)整生產(chǎn)工藝和貯藏環(huán)境仍然是目前主要控制措施。

對(duì)于EC檢測(cè)方法，GC-MS作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法具有靈敏度高、選擇性好和穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，而GC-MS/MS和HPLC-MS/MS能某種程度上降低檢測(cè)限并具有更好的選擇性，甚至能簡(jiǎn)化前處理過程，面對(duì)在線檢測(cè)的要求以及大量樣品需要篩查的情況下，便宜和操作簡(jiǎn)便的快速EC檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)，更能滿足企業(yè)、監(jiān)管機(jī)構(gòu)甚至是消費(fèi)者的要求。然而，目前迫切需要提高快速檢測(cè)方法的靈敏度和重復(fù)性，并簡(jiǎn)化前處理步驟，針對(duì)不同的快速檢測(cè)方法的缺點(diǎn)，努力方向不同：酶抑制法、薄層色譜法和FTIR法檢測(cè)限最高；SERS法在增強(qiáng)物的篩選和定量過程上還需要深入研究；由于能夠同時(shí)檢測(cè)大量樣品，ELISA檢測(cè)法前景廣闊，但衍生步驟延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間，迫切需要制備出更具EC特異性的抗體并研究EC直接檢測(cè)的ELISA法。這些快速檢測(cè)方法和含量控制方法的發(fā)展，對(duì)于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并降低發(fā)酵食品EC水平，降低EC致癌風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]NOMURA T.Urethan(ethyl carbamate) as a cosolvent of drugs commonly used parenterally in humans[J].Cancer Res,1975,35(10):2895-2899.

[2]JOHNSON R,FOWLER J,ZANELLL G.Changes in mouse blood pressure,tumor blood flow,and core and tumor temperatures following nembutal or urethane anesthesia[J].Radiology,1976,118(3):697-703.

[3]HIRSCHBOECK J S,LINDERT M,CHASE J,et al.Effects of urethane in the treatment of leukemia and metastatic malignant tumors[J].J Am Med Assoc,1948,136(2):90-95.

[4]NETTLESHIP A,HENSHAW P S,MEYER H L.Induction of pulmonary tumors in mice with ethyl carbamate(urethane)[J].Pediatr Int,1943,52(3):290-295.

[5]CADRANEL J,LEGENDRE C,DESAINT B,et al.Liver disease from surreptitious administration of urethane[J].J Clin Gastroenterol,1993,17(1):52-56.

[6]SCHLATTER J,LUTZ W K.The carcinogenic potential of ethyl carbamate(urethane):risk assessment at human dietary exposure levels[J].Food Chem Toxicol,1990,28(3):205-211.

[7]CHEN D,REN Y,ZHONG Q,et al.Ethyl carbamate in alcoholic beverages from China:levels,dietary intake,and risk assessment[J].Food Control,2017,72:283-288.

[8]LACHENMEIER D W,LIMA M C N,BREGA I C,et al.Cancer risk assessment of ethyl carbamate in alcoholic beverages from Brazil with special consideration to the spirits cacha?a and tiquira[J].BMC Cancer,2010,10(1):266-281.

[9]KIM Y G,LYU J,KIM M K,et al.Effect of citrulline,urea,ethanol,and urease on the formation of ethyl carbamate in soybean paste model system[J].Food Chem,2015,189:74-79.

[10]LIAO Q G,LUO L G.Fast and selective pressurized liquid extraction with simultaneous in-cell cleanup for the analysis of ethyl carbamate in fermented solid foods[J].Chromatographia,2014,77(13/14):963-967.

[11]LEE K G.Analysis and risk assessment of ethyl carbamate in various fermented foods[J].Eur Food Res Technol,2013,236(5):891-898.

[12]STEPAN H,PANI J,PUMMER S,et al.Sensitive Determination of ethyl carbamate in smokeless tobacco products and cigarette smoke using SPE and HPLC-APCI-MS/MS[J].Chromatographia,2015,78(9/10):675-681.

[13]LEE B Q,KHOR S M.3-Chloropropane-1,2-diol(3-MCPD) in soy sauce:a review on the formation,reduction and detection of this potential carcinogen[J].Compr Rev Food Sci F,2015,14(1):48-66.

[14]CHOI B,RYU D,KIM C,et al.Probabilistic dietary exposure to ethyl carbamate from fermented foods and alcoholic beverages in the Korean population[J].Food Addit Contam,2017,Doi.org/10.1080/19440049.2017.1364433.

[15]ZHANG J,FANG F,CHEN J,et al.The arginine deiminase pathway of koji bacteria is involved in ethyl carbamate precursor production in soy sauce[J].FEMS Microbiol Lett,2014,358(1):91-97.

[16]TANG A S P,CHUNG S W C,KWONG K,et al.Ethyl carbamate in fermented foods and beverages:dietary exposure of the Hong Kong population in 2007-2008[J].Food Addit Contam,2011,4(3):195-204.

[17]LIU Y,DONG B,QIN Z,et al.Ethyl carbamate levels in wine and spirits from markets in Hebei Province,China[J].Food Addit Contam,2011,4(1):1-5.

[18]WU P,PAN X,WANG L,et al.A survey of ethyl carbamate in fermented foods and beverages from Zhejiang,China[J].Food Control,2012,23(1):286-288.

[19]HUANG Z,PAN X D,WU P G et al.Validation(in-house and collaboratory) of the quantification method for ethyl carbamate in alcoholic beverages and soy sauce by GC-MS[J].Food Chem,2013,141(4):4161-4165.

[20]MO W M,HE H L,XU X M,et al.Simultaneous determination of ethyl carbamate,chloropropanols and acrylamide in fermented products,flavoring and related foods by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J].Food Control,2014,43:251-257.

[21]LI G,ZHONG Q,WANG D,et al.Determination and formation of ethyl carbamate in Chinese spirits[J].Food Control,2015,56:169-176.

[22]ZHAO X,JIANG C.Determination of ethyl carbamate in fermented liquids by ultra high performance liquid chromatography coupled with a Q exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer[J].Food Chem,2015,177:66-71.

[23]HASNIP S,CREWS C,POTTER N,et al.Survey of ethyl carbamate in fermented foods sold in the United Kingdom in 2004[J].J Agric Food Chem,2007,55(7):2755-2759.

[24]UTHURRY C A,VARELA F,COLOMO B,et al.Ethyl carbamate concentrations of typical Spanish red wines[J].Food Chem,2004,88(3):329-336.

[25]HASHIGUCHI T,HORII S,IZU H,et al.The concentration of ethyl carbamate in commercial ume(Prunusmume) liqueur products and a method of reducing it[J].Biosci Biotech Biochem,2010,74(10):2060-2066.

[26]RIACHI L G,SANTOS A,MOREIRA R F,et al.A review of ethyl carbamate and polycyclic aromatic hydrocarbon contamination risk in cachaca and other Brazilian sugarcane spirits[J].Food Chem,2014,149:159-169.

[27]ZHOU K,LIU Y,LI W Q,et al.An improved HPLC-FLD for fast and simple detection of ethyl carbamate in soy sauce and prediction of precursors[J].Food Anal Method,2017,DOI:10.1007/s12161-017-0948-5.

[28]顧青.氨基甲酸乙酯的綠色清潔合成工藝研究[D].上海:華東理工大學(xué),2013.

[29]趙鑫銳.代謝工程改造釀酒酵母降低黃酒中的氨基甲酸乙酯[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2014.

[30]ZHAO X,DU G,ZOU H,et al.Progress in preventing the accumulation of ethyl carbamate in alcoholic beverages[J].Trends Food Sci Tech,2013,32(2):97-107.

[31]SCHEHL B,SENN T,LACHENMEIER D W,et al.Contribution of the fermenting yeast strain to ethyl carbamate generation in stone fruit spirits[J].Appl Microbiol Biotech,2007,74(4):843-850.

[32]UTHURRY C,LEPE J S,LOMBARDERO J,et al.Ethyl carbamate production by selected yeasts and lactic acid bacteria in red wine[J].Food Chem,2006,94(2):262-270.

[33]GUO X W,LI Y Z,GUO J,et al.Reduced production of ethyl carbamate for wine fermentation by deletingCAR1 inSaccharomycescerevisiae[J].J Ind Microbiol Biotech,2016,43(5):671-679.

[34]WU D,LI X,SHEN C,et al.Decreased ethyl carbamate generation during Chinese rice wine fermentation by disruption ofCAR1 in an industrial yeast strain[J].Int J Food Microbiol,2014,180:19-23.

[35]CHIN Y W,KANG W K,JANG H W,et al.CAR1 deletion by CRISPR/Cas9 reduces formation of ethyl carbamate from ethanol fermentation bySaccharomycescerevisiae[J].J Ind Microbiol Biotech,2016,43(11):1517-1525.

[36]WU D,LI X,LU J,et al.Constitutive expression of theDUR1,2 gene in an industrial yeast strain to minimize ethyl carbamate production during Chinese rice wine fermentation[J].FEMS Microbiol Lett,2016,363(1):1-6.

[37]DAHABIEH M S,HUSNIK J I,VAN VUUREN H J.Functional expression of theDUR3 gene in a wine yeast strain to minimize ethyl carbamate in Chardonnay wine[J].Am J Enol Viticult,2009,60(4):537-541.

[38]DAHABIEH M S,HUSNIK J I,VAN VUUREN H J.Functional enhancement of Sake yeast strains to minimize the production of ethyl carbamate in Sake wine[J].J Appl Microbiol,2010,109(3):963-973.

[39]ZHOU J,KANG Z,LIU Q,et al.Degradation of urea and ethyl carbamate in Chinese rice wine by recombinant acid urease[J].Chin J Biotechnol,2016,32(1):74-83.

[40]AZEVEDO Z,COUTO J,HOGG T.Citrulline as the main precursor of ethyl carbamate in model fortified wines inoculated withLactobacillushilgardii:a marker of the levels in a spoiled fortified wine[J].Lett Appl Microbiol,2002,34(1):32-36.

[41]ROMERO S V,REGUANT C,BORDONS A,et al.Potential formation of ethyl carbamate in simulated wine inoculated withOenococcusoeniandLactobacillusplantarum[J].Int J Food Sci Tech,2009,44(6):1206-1213.

[42]張繼冉.醬油中氨基甲酸乙酯的產(chǎn)生機(jī)制和消除策略研究[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2016.

[43]CHOI B,KOH E.Changes of ethyl carbamate and its precursors in maesil(Prunusmume) extract during one-year fermentation[J].Food Chem,2016,209:318-322.

[44]GALINARO C A,OHE T H,DA SILVA A C,et al.Cyanate as an active precursor of ethyl carbamate formation in sugar cane spirit[J].J Agric Food Chem,2015,63(33):7415-7420.

[45]LI X,WANG P,WU D,et al.Effects of sterilization temperature on the concentration of ethyl carbamate and other quality traits in Chinese rice wine[J].J Inst Brewing,2014,120(4):512-515.

[46]XUE J,FU F,LIANG M,et al.Ethyl carbamate production kinetics during wine storage[J].Food Ferment Ind,2015,36(2):277-284.

[47]WEBER J V,SHARYPOV V I.Ethyl carbamate in foods and beverages:a review[J].Environ Chem Lett,2009,7(3):233-247.

[48]ARESTA M,BOSCOLO M,FRANCO D W.Copper(II) catalysis in cyanide conversion into ethyl carbamate in spirits and relevant reactions[J].J Agric Food Chem,2001,49(6):2819-2824.

[49]GU X L,TIAN Y P.Isolation and characterization of urethanase fromPenicilliumvariabileand its application to reduce ethyl carbamate contamination in Chinese rice wine[J].Appl Biochem Biotech,2013,170(3):718-728.

[50]PARK S R,HA S D,YOON J H,et al.Exposure to ethyl carbamate in alcohol-drinking and nondrinking adults and its reduction by simple charcoal filtration[J].Food Control,2009,20(10):946-952.

[51]RYU D,CHOI B,KIM N,et al.Validation of analytical methods for ethyl carbamate in nine food matrices[J].Food Chem,2016,211:770-775.

[53]JIAO Z,DONG Y,CHEN Q.Ethyl carbamate in fermented beverages:presence,analytical chemistry,formation mechanism,and mitigation proposals[J].Compr Rev Food Sci Food Safety,2014,13(4):611-626.

[54]劉麗斌.基于酶抑制法的酒精飲料中氨基甲酸乙酯的快速檢測(cè)的研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2014.

[55]STASYUK N Y,GAYDA G,FAYURA L,et al.Novel arginine deiminase-based method to assay l-arginine in beverages[J].Food Chem,2016,201:320-326.

[56]盧曉霞.雙酶?jìng)鞲衅鞯臉?gòu)建及氨基甲酸乙酯檢測(cè)應(yīng)用初探[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2015.

[57]JARYJ E,LORENZ K,SPANGENBERG B.A simple method for the quantification of urethane in spirits[J].J Liquid Chrom Relat Technol,2008,31(13):1969-1976.

[58]王浩.薄層數(shù)碼成像法對(duì)酒精飲料中氨基甲酸乙酯快速檢測(cè)的研究[D].廣州：華南理工大學(xué),2015.

[59]LACHENMEIER D W.Rapid screening for ethyl carbamate in stone-fruit spirits using FTIR spectroscopy and chemometrics[J].Anal Bioanal Chem,2005,382(6):1407-1412.

[60]楊丹婷.氨基甲酸乙酯和大腸桿菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)方法[D].杭州:浙江大學(xué),2013.

[61]LI M,ZHAO Y,CUI M,et al.SERS-active Ag nanostars substrates for sensitive detection of ethyl carbamate in wine[J].Anal Sci,2016,32(7):725-728.

[62]DU J,WANG H,WANG H,et al.Surface-enhanced raman scattering of ethyl carbamate adsorbed on Ag 20 cluster:enhancement mechanism[J].J Mol Struct,2017,1131:212-217.

[63]LUO L,LEI H T,YANG J Y,et al.Development of an indirect ELISA for the determination of ethyl carbamate in Chinese rice wine[J].Anal Chim Acta,2017,950:162-169.

[64]LUO L,SONG Y,ZHU C,et al.Fluorescent silicon nanoparticles-based ratiometric fluorescence immunoassay for sensitive detection of ethyl carbamate in red wine[J].Sensor Actuators B,2017,DOI:10.1016/j.snb.2017.09.088.

[65]LACHENMEIER D W,NERLICH U,KUBALLA T.Automated determination of ethyl carbamate in stone-fruit spirits using headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2006,1108(1):116-120.

[66]ZHANG J,LIU G,ZHANG Y,et al.Simultaneous determination of ethyl carbamate and urea in alcoholic beverages by high-performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection[J].J Agric Food Chem,2014,62(13):2797-2802.

[67]YANG D,MIRCESCU N E,ZHOU H,et al.DFT study and quantitative detection by surface-enhanced Raman scattering(SERS) of ethyl carbamate[J].J Raman Spectrosc,2013,44(11):1491-1496.

[68]YANG D,ZHOU H,YING Y,et al.Surface-enhanced Raman scattering for quantitative detection of ethyl carbamate in alcoholic beverages[J].Anal Bioanal Chem,2013,405(29):9419-9425.

[69]ZHANG J,DU G,CHEN J,et al.Characterization of aBacillusamyloliquefaciensstrain for reduction of citrulline accumulation during soy sauce fermentation[J].Biotechnol Lett,2016,38(10):1723-1731.