楊娜，劉豐林

(開封市中醫(yī)院，河南　開封　475001)

我國(guó)的糖尿病發(fā)病率高達(dá)9.7%，全國(guó)糖尿病人接近一億，并且有繼續(xù)增長(zhǎng)的勢(shì)頭[1]。中醫(yī)藥在糖尿病的治療方面歷史悠久、療效顯著，其整體調(diào)節(jié)的作用有著化學(xué)藥無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)[2-3]，在前人治療糖尿病的基礎(chǔ)上，依據(jù)辨證論治的原則，通過長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)篩選，開封市中醫(yī)院總結(jié)開發(fā)出十一味益腎降糖方，該方由黃芪、生地黃、白術(shù)、山茱萸、益母草、山藥等中藥組成，具有益氣健脾、補(bǔ)腎降糖、利水消腫之功能，方中黃芪、山藥補(bǔ)中益氣；生地黃、山茱萸止咳生津養(yǎng)陰。諸味藥合用，可發(fā)揮健脾益氣、清熱養(yǎng)陰之功能。在此方基礎(chǔ)上研制的十一味益腎降糖片，獲得河南省食品藥品監(jiān)督管理局院內(nèi)制劑批文(豫藥制字Z04020164)，在治療糖尿病、腎病方面具有較好療效[4]。

該方中山茱萸所含馬錢苷和莫諾苷是目前研究較多的藥效成分，具有廣泛的藥理活性。為了更加準(zhǔn)確全面地控制十一味益腎降糖片的質(zhì)量，本文建立了一種簡(jiǎn)單快速的LC-MS/MS法，用于同時(shí)測(cè)定十一味益腎降糖片中馬錢苷和莫諾苷的含量，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供良好的依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1 儀器

Finnigan TSQ Quantum Discovery液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)Thermo公司)；BS110S Sartorius電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；AS3120A 超聲清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；MICRO-17R高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試藥

十一味益腎降糖片開封市中醫(yī)院制劑室自制(批號(hào)分別為150630、160311、161218)；馬錢苷對(duì)照品、莫諾苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111640-201606、111998-201501)；色譜純甲醇；乙腈(美國(guó)TEDIA天地試劑公司)；水為哇哈哈純凈水。

2　方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Scientific Hypersil ODS色譜柱(50 mm ×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相為水-乙腈梯度洗脫，程序?yàn)?～0.50 min，5%～75%乙腈；0.50～2.00 min，75%～95%乙腈；2.00～2.01 min，95%～5%乙腈；2.01～3.50 min，5%乙腈；流速為0.35 mL·min-1；進(jìn)樣體積為10 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化(ESI)電離源；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，正離子模式。噴霧電壓4500 V；加熱毛細(xì)管溫度(TEM)為270 ℃；鞘氣流速30 psi；輔助氣流速15 psi；碰撞氣(CID)壓力為1.0 mTorr；源內(nèi)碰撞解離電壓(Source CID)為10 V；馬錢苷與莫諾苷的檢測(cè)離子對(duì)分別選擇：m/z 413.1/219.1和m/z 428.9/267.0，碰撞電壓分別為：34、23 eV[5-7]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定馬錢苷和莫諾苷對(duì)照品適量，置容量瓶中，加入甲醇溶液溶解，并定容至刻度，分別配制成馬錢苷(1.0 mg·mL-1)和莫諾苷(1.0 mg·mL-1)的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取10片十一味益腎降糖片，研細(xì)，過三號(hào)篩，精密稱定藥片細(xì)粉1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇(v/v)，密塞，精密稱定，加熱回流1 h，放冷，再精密稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用80%甲醇稀釋50倍，作為供試品溶液。

2.4 專屬性

取空白溶劑(80%甲醇)，混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣，得到典型色譜圖(見圖1)，馬錢苷出峰時(shí)間為1.74 min，莫諾苷出峰時(shí)間為1.65 min，雜質(zhì)在化合物出峰位置沒有干擾，證明方法的專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系

將馬錢苷和莫諾苷對(duì)照品溶液按照1∶1的體積比例進(jìn)行混合，得到馬錢苷和莫諾苷質(zhì)量濃度均為500 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，再依次稀釋，得到馬錢苷和莫諾苷質(zhì)量濃度均為10、50、200、500、1000、2000 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL，按照2.1色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以被測(cè)化合物的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)的線性相關(guān)系數(shù)。馬錢苷的線性回歸方程：Y=9.65×10-3X+3.72×10-1(r=0.998 2)，定量下限為10 ng·mL-1；莫諾苷的線性回歸方程：Y=3.18×10-3X+2.58×10-1(r=0.999 1)，定量下限為10 ng·mL-1。結(jié)果表明，馬錢苷和莫諾苷分別在10～2000 ng·mL-1濃度范圍和10～2000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取低、中、高3個(gè)濃度(10、500、2000 ng·mL-1)的混合對(duì)照品分別重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果馬錢苷的RSD分別為2.93%、2.54%、2.72%；莫諾苷的RSD分別為3.05%、2.91%、2.47%，表明該方法精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品，分別于0、3、6、12、24 h按2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果馬錢苷和莫諾苷峰面積的RSD分別為2.33%、2.84%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

注：A.莫諾苷；B.馬錢苷；Ⅰ.80%甲醇；Ⅱ.混合對(duì)照品；Ⅲ.供試品。圖1　典型色譜圖

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批號(hào)樣品6份，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品中馬錢苷和莫諾苷的含量。結(jié)果馬錢苷和莫諾苷峰面積的RSD分別為2.76%和3.12%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品約0.5 g，分別精密加入馬錢苷對(duì)照品溶液(1.0 mg·mL-1)425 μL和莫諾苷對(duì)照品溶液(1.0 mg·mL-1)460 μL，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.10 樣品測(cè)定

取3批十一味益腎降糖片，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，并按2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件測(cè)定，計(jì)算各批十一味益腎降糖片中馬錢苷、莫諾苷的含量，結(jié)果見表2。

表1　十一味益腎降糖片中馬錢苷和莫諾苷的加樣回收率(n=6)

表2　十一味益腎降糖片中馬錢苷和莫諾苷的含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌代謝疾病，發(fā)病率僅次于腫瘤和心血管疾病。中醫(yī)藥是抗糖尿病藥物開發(fā)的重要來(lái)源。已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)研究了中藥或植物藥以及其有效成分對(duì)糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的治療作用[8]。隨著越來(lái)越多的抗糖尿病中藥的開發(fā)，對(duì)于其質(zhì)量控制的要求也越來(lái)越高，從而更好地確保中藥安全性、有效性和質(zhì)量穩(wěn)定性。薄層色譜法、HPLC法等已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制應(yīng)用較為廣泛的方法，近年來(lái)，采用LC-MS/MS法作為中藥質(zhì)量控制的手段逐漸普及，該法更加快速、靈敏，具有更好的特異性。

通過優(yōu)化液相和質(zhì)譜參數(shù)，發(fā)現(xiàn)采用Thermo Scientific Hypersil ODS色譜柱(50 mm × 2.1 mm，5 μm)和以水-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，可以獲得合理的出峰時(shí)間、良好的峰形和分離度。質(zhì)譜檢測(cè)采用馬錢苷和莫諾苷的[M+Na]+峰，獲得了較為穩(wěn)定的質(zhì)譜響應(yīng)。

本文采用了LC-MS/MS方法測(cè)定十一味益腎降糖片中的馬錢苷和莫諾苷含量，方法專屬性好，分析速度快，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，為科學(xué)控制十一味益腎降糖片的質(zhì)量提供了重要的參考，為其臨床應(yīng)用提供了有力的保障，并且為將來(lái)更加深入研究該方劑的體內(nèi)過程奠定了基礎(chǔ)。

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