辛義周，聶金娥，馬傳江

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東　濟(jì)南　250011)

木瓜作為一種名貴的藥食兩用藥材，在我國研究及應(yīng)用歷史悠久，有“百益瓜果”之稱，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕[1]等功能。木瓜主產(chǎn)于四川、安徽、湖北、浙江等地，主要活性成分有三萜、有機(jī)酸、糖類、黃酮、揮發(fā)油等，而三萜類中的齊墩果酸和熊果酸是抗炎、護(hù)肝、祛風(fēng)濕的主要藥效成分[2]。

2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，木瓜的加工方法為新鮮木瓜置沸水中燙至外皮灰白色，對半縱剖，曬干。有文獻(xiàn)記載[3]，木瓜經(jīng)清炒后齊墩果酸和熊果酸的含量呈明顯上升趨勢，但未見有文獻(xiàn)報(bào)道清炒法對多產(chǎn)地多批次木瓜中兩者的含量比較研究，因此，本文采用HPLC法，對清炒后不同批次的木瓜中齊墩果酸、熊果酸進(jìn)行定量分析，為木瓜的質(zhì)量控制提供參考。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1206)；LC-600B型超聲清洗儀(山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司)；CP225D分析天平(奧豪斯國際貿(mào)易有限公司)；XMTD-4000恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。

1.2 試藥

齊墩果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110709-200304，純度為94.9%)；熊果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110742-201421，純度為99.3%)；甲醇、冰醋酸、乙腈、磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司，色譜純)；娃哈哈純凈水。

不同產(chǎn)地的木瓜經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定，均為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai的干燥近成熟果實(shí)。

1.3 樣品的前處理

生木瓜：取新鮮的木瓜，置沸水中燙至外皮呈灰白色，對半縱剖，曬干。粉碎，過60目篩，密封于自封袋中，備用。

木瓜炒制品：取生木瓜于炒鍋中，文火加熱，不斷攪拌使之受熱均勻，炒至表面微黃。迅速取出后烘干至恒重，粉碎，過60目篩，裝于密封袋內(nèi)，備用。

2　方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.6%磷酸(90∶10)；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。齊墩果酸、熊果酸的分離度大于1.5。

注：1.熊果酸；2.齊墩果酸。圖1　齊墩果酸和熊果酸對照品HPLC圖

注：1.熊果酸；2.齊墩果酸。圖2　木瓜HPLC圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備對照品儲(chǔ)備液的制備：分別精密稱取齊墩果酸對照品1.6 mg及熊果酸對照品4.0 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量濃度分別為151.84、400 μg·mL-1。

對照品溶液的制備：精密量取對照品儲(chǔ)備液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。齊墩果酸、熊果酸的質(zhì)量濃度分別為30.368、80 μg·mL-1。

2.2.2 供試品溶液的制備精密稱取木瓜樣品約1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，置超聲清洗儀中超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，以甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取混合對照品溶液(齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量濃度分別為151.84、400 μg·mL-1)1、3、5、7、9、11 μL，依次注入自動(dòng)進(jìn)樣器的高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制曲線方程，結(jié)果見表1。

表1　齊墩果酸、熊果酸的回歸方程和線性范圍

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液(齊墩果酸、熊果酸的質(zhì)量濃度分別為30.368、80 μg·mL-1)10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測定齊墩果酸、熊果酸的峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的峰面積RSD分別為0.69%(n=6)、0.99%(n=6)，表明本儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地(山東1)木瓜適量，研細(xì)，精密稱取木瓜粉末(過40目篩)約1.0 g，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸峰面積RSD分別為1.70%、0.69%。表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地(山東1)木瓜樣品適量，研細(xì)，稱取木瓜粉末(過40目篩)6份，每份約1.0 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.32、4.43 mg·g-1，RSD分別為1.77%、0.74%，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地(山東1)木瓜適量，研細(xì)，精密稱取已知含量的木瓜粉末(過40目篩)約0.5 g(齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.32、4.43 mg·g-1)，精密加入齊墩果酸和熊果酸10 mL(齊墩果酸和熊果酸對照品的質(zhì)量濃度分別為66.43、208 μg·mL-1)，按2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，每次進(jìn)樣10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定齊墩果酸和熊果酸峰面積，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表2～3，表明本方法具有較好的準(zhǔn)確性。

表2　齊墩果酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3　熊果酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地的木瓜樣品，按2.2.2項(xiàng)下制成供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按2.1項(xiàng)下進(jìn)行測定，每個(gè)樣品測定3次，取其平均值，計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的含量(均按干燥品計(jì)算)，結(jié)果見表4。

表4　不同產(chǎn)地木瓜生品及清炒品中齊墩果酸、熊果酸的含量　mg·g-1

3　討論

實(shí)驗(yàn)對甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇不同溶劑提取進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，甲醇為溶劑所得色譜峰分離度好，各峰峰面積積分值較大，說明以甲醇為提取溶劑提取較完全，所以確定甲醇為提取溶劑[4-6]；對常溫超聲法、加熱回流法及索氏提取法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，常溫下超聲提取較加熱回流、索氏提取各峰面積增加，所以選用超聲提取法提??；對超聲時(shí)間進(jìn)行了比較，分別超聲20、30、40 min，結(jié)果表明，隨提取時(shí)間的延長，30 min和40 min色譜圖基本一致，而與20 min色譜圖相比，熊果酸峰面積積分值有較大增加。因此，確定提取時(shí)間為30 min。

本實(shí)驗(yàn)對流動(dòng)相進(jìn)行了考察，以甲醇-0.6%磷酸、甲醇-1%冰醋酸及乙腈-0.6%磷酸3種流動(dòng)相系統(tǒng)做比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前兩種流動(dòng)相系統(tǒng)兩峰達(dá)不到基線分離，而乙腈-0.6%磷酸系統(tǒng)的分離效果佳，基線較為平穩(wěn)，所以選擇乙腈-0.6%磷酸為流動(dòng)相系統(tǒng)。齊墩果酸、熊果酸屬于同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)相似，采用高效液相色譜分離時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)兩種物質(zhì)的保留時(shí)間太接近，分離度達(dá)不到要求。本實(shí)驗(yàn)考察了1、0.9、0.8 mL·min-1流速對色譜峰保留時(shí)間的影響，結(jié)果0.8 mL·min-1的流速保留時(shí)間適中，齊墩果酸、熊果酸分離度大于1.5，因此選擇0.8 mL·min-1的流速[7-8]。

不同產(chǎn)地的木瓜中齊墩果酸、熊果酸含量存在差異，其中以安徽宣城所產(chǎn)的木瓜二者含量最高，廣西、福建、云南所產(chǎn)較低，分析可能與藥材的產(chǎn)地、采收時(shí)間、儲(chǔ)藏條件等因素有關(guān)。木瓜清炒后齊墩果酸和熊果酸的含量總體呈上升趨勢，其中以浙江淳安增長比例最大，云南木瓜增長比例最小，推測為木瓜中部分齊墩果酸和熊果酸的苷經(jīng)炮制后轉(zhuǎn)化為苷元所致[9]。因此木瓜藥材使用過程中應(yīng)嚴(yán)格控制其炮制方法，在炮制過程中如何控制條件避免成分損失需要進(jìn)一步的研究和探索。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥出版社，2015.

[2]曾小威，李世剛，喻玲玲，等.木瓜中單體化合物及其藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2016，27(1)：101-104.

[3]王光寧，崔升淼，梁炳健.炮制方法對木瓜中齊墩果酸和熊果酸含量的影響[J].齊魯藥事，2012，31(12)：695-697.

[4]陳建真，敖志輝，陳建明.不同產(chǎn)地和品種木瓜及其酒制品中齊墩果酸和熊果酸的含量測定研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(10)：2194-2196.

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