席曉志，王婉卿，崔曉偉，郭弘，鄭夢夢，李玉娟，許方雪，吳春芳，武俊明，李佳*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東　濟(jì)南　250355；2.江蘇中興藥業(yè)有限公司，江蘇　鎮(zhèn)江　212143)

藥用杜仲EucommiaulmoidesOliver即為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，是中國名貴滋補(bǔ)藥材[1]。杜仲具有清除體內(nèi)垃圾、加強(qiáng)人體細(xì)胞物質(zhì)代謝、防止肌肉骨骼老化、平衡人體血壓、分解體內(nèi)膽固醇、降低體內(nèi)脂肪、恢復(fù)血管彈性、利尿清熱、廣譜抗菌、興奮中樞神經(jīng)、提高白血球藥理作用、抗氧化、抗衰老的作用[2-5]?，F(xiàn)代研究表明，杜仲的抗氧化成分主要為黃酮類[6-7]。但是關(guān)于杜仲中總提取物的抗氧化活性與單一有效成分的比較研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化杜仲醇提物的提取工藝，使用線蟲壽命實(shí)驗(yàn)考察杜仲總提取物抗氧化效果，為杜仲的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1　試藥與儀器

1.1 試藥

杜仲(浙江普正藥業(yè)公司，批號：20130306)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為杜仲。乙醇(分析純，萊陽市康德化工有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；5-氟尿嘧啶(北京鼎國昌盛生物公司)；硫酸亞鐵、鄰二氮菲(1，10-菲羅啉)、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)(分析純，阿拉丁上海試劑有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·，美國Sigma公司)試劑盒；超氧陰離子自由由基(O2-)測試盒；羥自由基(OH)試劑盒；線蟲凍存液：NaCl 5.85 g、KH2PO46.8 g、甘油300 g、1 M NaOH 5.6 mL，加H2O至1 L，121 ℃滅菌20 min，加入滅菌的0.1 M MgSO43 mL，4 ℃保存；NGM固體培養(yǎng)基(氯化鈉3 g·L-1、瓊脂粉17 g·L-1、胰蛋白胨2.5 g·L-1、1 mL 5mg·mL-1膽固醇乙醇溶液，加入970 mL蒸餾水，121 ℃滅菌15 min，冷卻至55 ℃后無菌條件下加入1 M CaCl2、1 M MgSO4及25 mL 1 M PH6.0的PB緩沖液)。

1.2 儀器

UV9000紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；高壓滅菌鍋(日本三羊公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；生化培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)公司)；高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)；千分之一分析天平(上海天平儀器廠)；萬分之一分析天平(上海菁海儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華公司儀器有限責(zé)任公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工茂有限公司)；恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)；真空濃縮箱(上海樹立儀器儀表有限公司)。

2　方法

2.1 杜仲提取物樣品的制備

杜仲皮粉碎機(jī)粉碎成中粉，加8倍量50%的乙醇，70 ℃水浴加熱的條件下提取兩次，每次2 h，過濾，收集，濃縮提取液至1 mL·g-1(每1 mL相當(dāng)于原藥1 g)，得到杜仲提取物樣品備用。

2.2 杜仲抗氧化能力的體外測定方法

2.2.1 對羥自由基清除能力的測定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[8]。在0.75 mol·L-1鄰二氮菲溶液1 mL中，依次加入2 mL PBS液和不同濃度的樣品液1 mL，充分混勻后，加入0.75 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液1 mL與0.01%H2O21 mL，于37 ℃下溫育60 min，于536 nm處測其吸光度As。同時(shí)以去離子水為空白對照測Ab，不加樣品加H2O2測Ap。以VC為標(biāo)準(zhǔn)對照，按下式計(jì)算羥自由基清除率。

(1)

2.2.2 對超氧陰離子自由基清除能力的測定利用鄰苯三酚自氧化體系測定糖胺聚糖對超氧陰離子自由基(O-2·)的清除作用[9]。取4.5 mL(pH 8.2)的Tris-HCl緩沖液于25 ℃水中預(yù)熱20 min，分別加入1 mL糖胺聚糖溶液和0.4 mL(25 mmol·L-1)的鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)4 min，加入8 mol·L-1的HCl終止反應(yīng)，299 nm處測吸光度(A1)。以1 mL蒸餾水代替待測液作空白A0。

(2)

2.2.3 對DPPH自由基清除能力的測定取2 mL樣品溶液，加入2 mL 1×10-4mol·L-1DPPH溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min，并在4000 r·min-1下離心10 min，以等體積的去離子水代替樣品溶液作對照組，以等體積的95%乙醇代替DPPH溶液作空白組，在517 nm下測定吸光度，并以等體積樣品溶液和95%乙醇混合液為空白調(diào)零，并做平行，取平均值[10]。

(3)

2.2.4 綜合評分的確定根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，藥物抗氧化指標(biāo)中對羥自由基清除能力、對DPPH自由基清除能力和對超氧陰離子自由基清除能力同等重要，因此三者的權(quán)數(shù)都取1，計(jì)算加權(quán)指標(biāo)得出綜合評分。

2.3 杜仲提取的單因素考察

2.3.1 提取時(shí)間對杜仲提取物抗氧化能力的影響設(shè)定提取時(shí)間分別為1.5、1.75、2、2.25、2.5 h。其他工藝條件：取100.0 g杜仲，加8倍量50%的乙醇，70 ℃水浴加熱提取兩次，研究不同提取時(shí)間對杜仲提取物3種指標(biāo)的影響。

2.3.2 提取溫度對杜仲提取物抗氧化能力的影響設(shè)置水浴溫度為50、60、70、80、90 ℃。其他工藝條件：取100.0 g杜仲，加8倍量50%的乙醇，水浴加熱提取兩次，每次提取2 h，研究不同提取溫度對杜仲提取物3種指標(biāo)的影響。

2.3.3 溶劑體積對杜仲提取物抗氧化能力的影響加入溶劑體積分別為7、8、9、10、11倍量。其他工藝條件：取100.0 g杜仲，加規(guī)定量50%的乙醇，70 ℃水浴加熱提取兩次，每次提取2 h，研究不同溶劑體積對杜仲提取物3種指標(biāo)的影響。

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化杜仲的最佳提取工藝

響應(yīng)面法(Response Surface Methodology)是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝。參數(shù)是解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法，是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法(DOE，design of experiment)的一種。用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝過程主要涉及3步：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；建立數(shù)學(xué)模型評估相關(guān)性；預(yù)測響應(yīng)值研究模型的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中經(jīng)典方法是固定其他參數(shù)，一次只研究一個(gè)變量，這種研究方法極其低效，響應(yīng)面法因其提供了響應(yīng)面區(qū)域內(nèi)的必要信息、擴(kuò)展了有限的資源而高效得多。響應(yīng)面法使得參數(shù)間的交互作用通過有限次試驗(yàn)來評估成為可能。

本試驗(yàn)在杜仲提取的單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken Design響應(yīng)面優(yōu)化法，選取試驗(yàn)過程中的提取溫度(A)、提取時(shí)間(C)、溶劑體積(B)作為影響因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，應(yīng)用分析統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert v8.0.5b對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并對結(jié)果進(jìn)行分析。響應(yīng)面分析因素與水平見表1，響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平

表2　響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

2.5 使用秀麗隱桿線蟲驗(yàn)證杜仲提取物的抗氧化效果

2.5.1 線蟲和藥物的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備將預(yù)處理好的線蟲經(jīng)過復(fù)蘇、同期化、傳代培養(yǎng)后，在-70～-110 ℃的條件下保存為實(shí)驗(yàn)備用。在實(shí)驗(yàn)室條件下線蟲以大腸桿菌OP50為食。線蟲培養(yǎng)所使用的是一次性塑料6 cm直徑的無菌平板。每板約鋪2/3厚度的瓊脂，保證無氣泡。平板在室溫超凈臺內(nèi)紫外殺菌1～2 d，以消除污染物影響以及讓過量水分蒸發(fā)掉，然后密封儲存于培養(yǎng)箱或室溫，可用幾周。實(shí)驗(yàn)藥物為2.1中所述制備備用的杜仲提取物樣品以及根據(jù)文獻(xiàn)[11-13]中方法分離提取的杜仲總黃酮樣品(經(jīng)蘆丁對照測定其純度為78%)。

2.5.2 線蟲壽命測定實(shí)驗(yàn)選取同期化的L4期秀麗隱桿線蟲，每組50只，挑至已加藥的各組。本實(shí)驗(yàn)的分組為：對照組、杜仲提取物組、杜仲總黃酮給藥組。線蟲從同期化的卵開始記為0 d，給藥當(dāng)天根據(jù)線蟲年齡來標(biāo)記。由于線蟲產(chǎn)卵會持續(xù)到8 d齡，所以在給藥初期即L4期，為防止卵及幼蟲發(fā)育干擾測定，每天將待測定線蟲挑到新板內(nèi)。NGM平板在20 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育。成蟲不再產(chǎn)卵后可兩天一次挑到新板內(nèi)。當(dāng)反復(fù)輕輕觸碰，線蟲對挑蟲器沒有反應(yīng)時(shí)，線蟲被記為死亡。當(dāng)線蟲爬壁死亡的或因蟲袋死亡的記為丟失。每天挑蟲直到全部死亡。

3　結(jié)果分析

3.1 杜仲提取的單因素考察結(jié)果分析

3.1.1 提取時(shí)間對杜仲提取物抗氧化能力的影響結(jié)果提取時(shí)間對杜仲提取物抗氧化能力的影響結(jié)果見圖1，當(dāng)提取時(shí)間設(shè)置為2 h時(shí)，提取率變化最大，當(dāng)提取時(shí)間再增加時(shí)，杜仲提取物的抗氧化能力增幅不大。這可能與有效成分提取完全有關(guān)。

圖1　提取時(shí)間的影響結(jié)果

3.1.2 提取溫度對杜仲提取物抗氧化能力的影響結(jié)果提取溫度對杜仲提取物抗氧化能力的影響結(jié)果見圖2，在50～70 ℃，杜仲提取物的抗氧化能力隨溫度的增加而增加，當(dāng)提取時(shí)間再增加時(shí)，杜仲提取物的抗氧化能力增幅不大。這可能與有效成分提取完全有關(guān)。

圖2　提取溫度影響結(jié)果

3.1.3 溶劑體積對杜仲提取物抗氧化能力的影響結(jié)果溶劑體積對杜仲提取物抗氧化能力的影響結(jié)果見圖3，在8倍體積之前的范圍內(nèi)，杜仲提取物的抗氧化能力隨溶劑體積的增加而增加，當(dāng)溶劑體積再增加時(shí)，杜仲提取物的抗氧化能力增幅不大。這可能與有效成分提取完全有關(guān)。

圖3　溶劑體積影響結(jié)果

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化杜仲提取工藝的結(jié)果

由方差分析表3可以得到，此模型達(dá)到顯著(P<0.01)，二次回歸模型中的決定系數(shù)是A2、B2、C2，其Prob>F值分別為0.007、0.041 2、0.002 5，即提取溫度和提取時(shí)間對提取率的影響較大，溶劑體積對提取率的影響較小。

表3　方差分析表

方差分析結(jié)果表明，選取的3個(gè)因素對響應(yīng)值(綜合評分值)的影響并不是一種線性關(guān)系，提取溫度、提取時(shí)間、溶劑體積3個(gè)因素在試驗(yàn)過程中都起了作用，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有很大的影響。以綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，分別對提取溫度A、提取時(shí)間C、溶劑體積B(自變量)進(jìn)行二次方程擬合，得到以杜仲提取物抗氧化能力綜合評分(Y)為響應(yīng)值，3個(gè)參數(shù)(提取溫度、提取時(shí)間、溶劑體積)為自變量的二次回歸模擬方程：Y=-24.045 45+0.299 49 A+1.224 85B+10.162 05C+5.75×10-4AB-0.010 370AC+0.009 000 0BC-1.995 3×10-3A2-0.087 412B2-2.576 60C2，通過實(shí)驗(yàn)分析可知，二次回歸模擬方程的“Prob>F”值小于0.01，表明該模擬二次方程高度顯著，失擬項(xiàng)顯著，回歸方程擬合程度較好。因此，說明響應(yīng)面分析法所得到的二次回歸方程是準(zhǔn)確、可靠的，能夠用這個(gè)方程來模擬真實(shí)的三因素三水平的分析。圖4～6是各因子交互作用的等高線和響應(yīng)面。

圖4表明，提取溫度和溶劑體積的交互作用對綜合評分的影響較大。由等高線圖可以看出，沿提取溫度軸向等高線變化密集，沿溶劑體積軸向等高線變化稀疏，說明提取溫度比提取時(shí)間更能影響綜合評分大小。由響應(yīng)面圖可以看出，提取溫度過高或過低都會降低綜合評分。

圖4　Y=f(A，B)淫羊藿提取物等高線和響應(yīng)面3D圖譜

圖5　Y=f(A，C)淫羊藿提取物等高線和響應(yīng)面3D圖譜

圖6　Y=f(B，C)淫羊藿提取物等高線和響應(yīng)面3D圖譜

圖5表明，提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對綜合評分的影響不大。由等高線圖可以看出，沿提取溫度軸向等高線變化密集，沿溶劑體積軸向等高線變化稀疏，說明提取溫度比提取時(shí)間更能影響綜合評分大小。

圖6表明，提取時(shí)間和溶劑體積的交互作用對杜仲提取物抗氧化綜合評分的影響較大。由等高線圖可以看出，沿提取時(shí)間軸向等高線變化密集，沿溶劑體積軸向等高線變化稀疏，說明提取時(shí)間比溶劑體積更能影響綜合評分的大小。

由Box-Behnken Design軟件分析得到杜仲提取的最佳工藝條件：提取溫度為71.25 ℃、提取時(shí)間為1.98 h、溶劑體積為8.27 mL·g-1，理論上預(yù)測綜合評分值大小為1.680 08。對優(yōu)化的最佳提取條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，考慮到實(shí)際操作、節(jié)省時(shí)間、降低能耗等問題，將提取杜仲的最佳工藝條件修正為提取溫度：70 ℃、提取時(shí)間：2 h、溶劑體積：8 mL·g-1。

3.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為了便于試驗(yàn)驗(yàn)證，使用最佳工藝修正后的條件：提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為2 h、溶劑體積為8 mL·g-1，進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證(n=3)，實(shí)際測得的綜合評分值為1.670 05，這與理論預(yù)測值1.680 08相比無顯著性差異(P>0.05)。因此，采用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的杜仲提取物提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有使用價(jià)值。

3.4 線蟲壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果

線蟲壽命實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表5，使用最佳工藝提取的杜仲提取物給藥組的平均壽命相對于對照組和杜仲總黃酮給藥組的線蟲壽命有了一個(gè)明顯的提高，杜仲使用優(yōu)化后的提取方法提取出的提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性。

表5　線蟲壽命實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

4　討論

本實(shí)驗(yàn)以羥基自由基、超氧去離子自由基、DPPH自由基的清除能力為指標(biāo)，使用響應(yīng)面優(yōu)化分析法優(yōu)化杜仲的提取工藝：提取溫度為71.25 ℃、提取時(shí)間為1.98 h、溶劑體積為8.27 mL·g-1，理論上預(yù)測綜合評分值大小為1.680 08。使用優(yōu)化后的工藝提取杜仲并進(jìn)行線蟲壽命實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證提取物的抗氧化和抗衰老效果。通過線蟲壽命實(shí)驗(yàn)證明，使用優(yōu)化后的提取方法提取出的提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性。且通過與對照組和總黃酮給藥組線蟲壽命實(shí)驗(yàn)的比較，發(fā)現(xiàn)杜仲提取物給藥組使線蟲壽命顯著增強(qiáng)，說明杜仲中總提取物具有的抗氧化效果比單一的杜仲總黃酮成分效果明顯，為杜仲的抗氧化功能的研究提供了一定的參考。但是，本實(shí)驗(yàn)沒有具體地研究是杜仲醇提物中還有哪些成分具有抗氧化效果，且對比指標(biāo)不具備多樣化，因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步的探討。

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