周青，孫長俠，孫斐，荀麗英

(1.聊城市中醫(yī)醫(yī)院，山東　聊城　252000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東　濟(jì)南　250355)

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌發(fā)病率和病死率均居世界之首。5年生存率僅為20%～30%，死亡率居惡性腫瘤的第四位[1]。順鉑(cis-Dichlorodiamineplatinum，DDP)是臨床用于腫瘤化療的常用藥物，但它引起的骨髓抑制、免疫低下等不良反應(yīng)嚴(yán)重降低了腫瘤患者的生存質(zhì)量[2-3]，限制了其在臨床的使用。

啟膈方是由《醫(yī)學(xué)心悟》治療噎嗝的啟膈散化裁而來，是聊城市中醫(yī)醫(yī)院治療食管癌、胃癌及術(shù)后患者放、化療的常用輔助用藥，并且取得了較好的臨床療效，可改善食管癌、胃癌患者吞咽不順、胃脘脹痛、納差、泛吐痰涎等癥狀；對于食管癌、胃癌術(shù)后患者及放化療患者可改善胃運(yùn)動(dòng)功能，增加食欲，減輕燒心、吐酸，減少癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，延長生存時(shí)間[4]。但啟膈化痰合劑在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)對順鉑的增效減毒作用尚未見報(bào)道。本研究采用小鼠Eca109皮下移植瘤模型對啟膈化痰合劑的增效減毒作用進(jìn)行研究，旨在為啟膈化痰合劑的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

啟膈化痰合劑(QGHT)由聊城市中醫(yī)醫(yī)院提供(批號(hào)：20161213，方藥組成：瓜蔞、浙貝母、清半夏、橘紅、半枝蓮、蚤休、白術(shù)、生薏苡仁、露蜂房、砂仁、酒大黃、黃連、膽南星、丹參等)；順鉑注射液(江蘇豪森制藥股份有限公司)；CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]；兔抗NFκB及兔抗p-IκBα(Santa cruze；SDS-PAGE Gel Kit)，BCA蛋白定量試劑盒/高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

K562細(xì)胞及食管癌Eca109細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。雞紅細(xì)胞及綿羊紅細(xì)胞(北京信利來生物科技有限公司)。ICR小鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。

2　方法

2.1 腫瘤模型的建立

將Eca109細(xì)胞以1×107·mL-1的濃度接種于小鼠右前肢皮下，每只注射0.2 mL細(xì)胞懸液。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

接種Eca109細(xì)胞24 h后將小鼠隨機(jī)分為模型組、DDP對照組(2 mg·kg-1)，DDP(2 mg·kg-1)+QGHT低劑量組(50 mg·kg-1)、DDP(2 mg·kg-1)+QGHT中劑量組(100 mg·kg-1)、DDP(2 mg·kg-1)+QGHT(200 mg·kg-1)高劑量組，每組10只，另設(shè)正常對照組10只。正常組、模型組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 mL·kg-1，每天1次；DDP組腹腔注射DDP 2 mg·kg-1，每2 d 1次；DDP+QGHT低劑量組、DDP+QGHT中劑量組、DDP+QGHT高劑量組，腹腔注射DDP 2 mg·kg-1，每2 d 1次，同時(shí)分別灌胃給藥50、100、200 mg·kg-1，每天1次。以上各組連續(xù)給藥14 d。

2.3 啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑對Eca109荷瘤鼠抑瘤率及臟器指數(shù)的影響

末次給藥 24 h后，小鼠脫頸椎處死，剝離瘤塊并稱取瘤質(zhì)量，按公式(1)計(jì)算抑瘤率；同時(shí)剝離脾臟稱質(zhì)量，按公式(2)計(jì)算脾臟指數(shù)。

抑瘤率=(模型組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%

(1)

臟器指數(shù)=免疫器官質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

(2)

2.4 啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑對Eca109荷瘤小鼠外周血WBC數(shù)及骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響

小鼠處死前一天，末次給藥1 h后，尾尖取血10 μL置于1.5 mL的EP管中，用3%的稀醋酸稀釋，待紅細(xì)胞充分裂解后于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。

末次給藥24 h后，小心剝離右側(cè)股骨，吸取0.5 mL Hank’s液，通過注射器針頭反復(fù)沖洗骨髓，收集洗液，用3%的稀醋酸稀釋10倍后在顯微鏡下計(jì)數(shù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)。

2.5 啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑對Eca109荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響[5]

于給藥第10 d小鼠腹腔注射2%(V/V)的綿羊紅細(xì)胞懸液，0.2 mL/只。于末次給藥24 h后處死小鼠，每只小鼠腹腔注射等量的Hank’s液(含5% FBS)，輕揉腹部并吸取腹腔洗液。將腹腔洗液與等量1%的雞紅細(xì)胞懸液輕輕吹打混勻，滴于玻片上并推平，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。孵育結(jié)束后沖洗玻片并用甲醇進(jìn)行固定。最后用Giemsa染液染色10 min，染色結(jié)束后玻片用蒸餾水沖洗玻片并晾干。油鏡下觀察吞噬情況并按公式(3)計(jì)算吞噬率，共計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

吞噬率=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞總數(shù))×100%

(3)

2.6 啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑對Eca109荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性的影響

末次給藥24 h后小鼠脫頸椎處死，NK細(xì)胞活性測定按照CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明操作進(jìn)行檢測。即無菌取脾，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液并裂解紅細(xì)胞后，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為 2×107個(gè)·mL-1；實(shí)驗(yàn)前一天將K562細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用時(shí)將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×105個(gè)·mL-1。反應(yīng)孔加入K562細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液各50 μL(效靶比50∶1)，輕輕吹勻后加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板；靶細(xì)胞自然釋放孔則加入K562細(xì)胞和培養(yǎng)液各50 μL；靶細(xì)胞最大釋放孔加入K562細(xì)胞和裂解液各50 μL；上述各項(xiàng)設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，離心后，輕輕吸取50 μL上清液置96孔板中，加入底物混合物50 μL，振搖混勻后于避光條件下室溫孵育 30 min，最后加入50 μL終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上于490 nm 處測定吸光度(A)值，按公式(4)計(jì)算NK細(xì)胞活性。

NK細(xì)胞活性=(A反應(yīng)孔-A自然釋放孔)/(A最大釋放孔-A自然釋放孔)×100%

(4)

2.7 啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑對Eca109荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響

末次給藥24 h后，在無菌環(huán)境下取脾，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液并調(diào)整脾細(xì)胞濃度為5×106個(gè)·mL-1，取300 μL加入48孔板中。加入等量的 Con A液使Con A的終質(zhì)量濃度為9 μg·mL-1，將培養(yǎng)板置含5% CO2的孵箱中于37 ℃培養(yǎng)44 h，培養(yǎng)結(jié)束后加入30 μL質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT(0.9%氯化鈉溶液配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后，小心吸取240 μL上清液棄去，加入240 μL細(xì)胞裂解液，置5%的 CO2孵箱中于37 ℃過夜培養(yǎng)，于570 nm波長處測定吸光度(A)值。

2.8 Western blotting分析

取腫瘤組織約100 mg，剪碎，加入1 mL RIPA裂解液并用勻漿器勻漿充分裂解腫瘤組織，12 000 g(4 ℃)離心10 min，收集上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度并調(diào)整各組蛋白至相同蛋白濃度。將蛋白與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液以4∶1的比例混合，沸水煮10 min。取20 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)于PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST液封閉2 h。加入兔抗NFκB、兔抗P-IκBα(1∶300稀釋)置于4 ℃冰箱中孵育過夜，TBST洗滌3次，每次15 min。用山羊抗兔二抗(1∶2000稀釋)孵育1 h后TBST洗滌3次，每次10 min。使用高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行顯影，并用Image-J軟件分析各蛋白相對表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3　結(jié)果

3.1 啟膈化痰合劑對Eca109荷瘤小鼠抑瘤率的影響

表1結(jié)果顯示，與模型組相比，各給藥組均有明顯的抑瘤作用(P<0.01)，其中DDP+QGHT中劑量組、DDP+QGHT高劑量組的抑瘤率分別為60.74%和58.92%，明顯優(yōu)于單用DDP組(P<0.01)，表明啟膈化痰合劑中、高劑量能明顯增強(qiáng)DDP的抑瘤作用。

表1　啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑給藥對Eca109荷瘤小鼠抑瘤率的影響

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；與DDP組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.2 啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑給藥對Eca109荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響

表2結(jié)果顯示，與模型對照組比較，DDP組小鼠的脾臟指數(shù)顯著降低，外周血WBC數(shù)及骨髓有核細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01)。與單用DDP組小鼠比較，DDP+QGHT中劑量組、DDP+QGHT高劑量組荷瘤小鼠脾臟指數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。

表2　啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑給藥對免疫器官指數(shù)、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

注：與空白對照組比較，△△P<0.01，△P<0.05；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；與DDP組比較，##P<0.01，#P<0.05；下同。

3.3 啟膈化痰合劑對Eca109細(xì)胞荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響

表3結(jié)果顯示，小鼠接種Eca109后，腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率明顯下降(P<0.01)。DDP組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率進(jìn)一步降低，而DDP+QGHT中劑量組、DDP+QGHT高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率與DDP組比較，顯著升高(P<0.01)。

表3　啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑給藥對Eca109荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響

3.4 啟膈化痰合劑對Eca109細(xì)胞荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性的影響

表4結(jié)果顯示，與模型組相比，DDP組小鼠的NK細(xì)胞活性顯著降低(P<0.01)。DDP+QGHT低劑量組、DDP+QGHT中劑量組、DDP+QGHT高劑量組小鼠的NK細(xì)胞活性較DDP組顯著升高(P<0.01，P<0.05)。

3.5 啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑給藥對荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響

表5結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖沒有明顯變化。而與模型組比較，DDP組荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖有明顯下降。DDP+QGHT中劑量組、DDP+QGHT高劑量組與單用DDP組比較，可顯著提升脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力(P<0.01，P<0.05)。

表4　啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑給藥對Eca109荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性的影響

表5　啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑給藥對Eca109荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響

3.6 啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑對NFκB信號(hào)通路的影響

與模型組比較，DDP+QGHT中劑量組、DDP+QGHT高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織中的p-IκBα、NFκB水平顯著降低(P<0.01)，而單用DDP組荷瘤小鼠腫瘤組織中的NFκB水平?jīng)]有顯著性變化。p-IκBα及NFκB在DDP+QGHT中劑量組、DDP+QGHT高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織中的表達(dá)水平與單用DDP組比較，同樣顯著降低(P<0.01)。見圖1。

注：A.p-IκBα及NFκB蛋白表達(dá)；B.p-IκBα及NFκB蛋白相對表達(dá)量；1.模型組；2.DDP組；3.DDP+QGHT低劑量組；4.DDP+QGHT中劑量組；5.DDP+QGHT高劑量組。圖1　啟膈化痰合劑聯(lián)合順鉑對Eca109荷瘤小鼠腫瘤組織中的p-IκBα、NFκB水平的影響

4　討論

食管癌是嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的疾病之一。大多數(shù)食管癌確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，對晚期食管癌的治療只能采用放療、化療相結(jié)合模式[6]。但大多數(shù)化療藥物缺乏腫瘤細(xì)胞特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的分裂增殖旺盛的正常細(xì)胞具有殺傷作用，產(chǎn)生骨髓抑制，影響T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞正常的增殖活化，從而引起機(jī)體免疫功能的抑制，嚴(yán)重影響到惡性腫瘤的治療[7-8]。因此，提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)化療藥物療效，降低其不良反應(yīng)，尤其是預(yù)防治療患者化療后出現(xiàn)的免疫功能抑制，是有效改善食管癌患者生存條件的關(guān)鍵。

啟膈化痰合劑甘寒濡潤，是在古方的基礎(chǔ)上，根據(jù)多年臨床應(yīng)用體會(huì)，按照中醫(yī)理法方藥和君臣佐使配伍而成，方中瓜蔞，甘、微苦，性寒，歸肺、胃、大腸經(jīng)，具有清熱化痰、寬胸散結(jié)、潤腸通便功能，為君藥。浙貝母，味苦，性寒，歸肺、心經(jīng)，能清熱化痰止咳、解毒散結(jié)消癰；清半夏，味辛，性溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，能燥濕化痰；白術(shù)，味苦、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)，能補(bǔ)氣健脾、燥濕利水：為臣藥。生薏苡仁，味甘、淡，性涼，歸脾、胃、肺經(jīng)，能利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結(jié)；砂仁，味辛，性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)，能化濕開胃、溫脾止瀉、理氣；橘紅，味辛、苦，性溫，歸肺、脾經(jīng)，能理氣寬中、燥濕化痰；丹參，味苦，性微寒，歸心、肝二經(jīng)，能清心除煩、涼血消癰；膽南星，清熱化痰；半枝蓮、重樓、黃連清熱解毒；露蜂房，解毒：共為佐藥。旋覆花降逆化痰、降逆止嘔，酒大黃活血祛瘀：為使藥。啟膈方臨床應(yīng)用取得了一定的成效[9-11]，但其免疫調(diào)節(jié)作用及對順鉑的增效減毒作用尚缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠的Eca109皮下移植瘤模型，研究啟膈化痰合劑的免疫調(diào)節(jié)作用及對順鉑的增效減毒作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠接種Eca109瘤株以后，會(huì)出現(xiàn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能下降、NK細(xì)胞活性降低等免疫抑制狀態(tài)，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]。給予啟膈化痰合劑治療后，可提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力以及提高NK細(xì)胞活性。因此，可以提高機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。在啟膈化痰合劑與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DDP的抑瘤效果顯著，但是引起了免疫器官指數(shù)下降，外周血WBC數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)下降、T淋巴細(xì)胞增殖抑制等免疫功能低下狀態(tài)。啟膈化痰合劑與DDP聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高對小鼠Eca109實(shí)體瘤的抑瘤作用，啟膈化痰合劑聯(lián)合DDP治療組的抑瘤率要顯著高于單用DDP組。啟膈化痰合劑與DDP聯(lián)合應(yīng)用對DDP引起的脾臟指數(shù)、外周血WBC數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)下降及T淋巴細(xì)胞增殖抑制等免疫功能低下狀態(tài)也具有一定的改善作用。同時(shí)，啟膈化痰合劑聯(lián)合DDP可顯著抑制NFκB通路。以上結(jié)果顯示：啟膈化痰合劑對荷瘤小鼠的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用，并可對抗化療藥物DDP所導(dǎo)致的機(jī)體免疫功能的抑制，使機(jī)體的免疫功能得到恢復(fù)，提高機(jī)體的抗腫瘤作用。該研究為啟膈化痰合劑臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

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