張賽，王付海，溫慶彬，趙玉成，吳志正，田虎

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床學(xué)院，山東 濟南 250000；2.山東省千佛山醫(yī)院 普外中心，山東 濟南 250000）

隨著生活水平的提高，胰腺炎發(fā)生率也在明顯提高，追求更多減緩胰腺炎炎癥的進(jìn)程和促進(jìn)機體機能快速恢復(fù)的方法成為了當(dāng)前的研究焦點。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein, HMGB1）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）是SAP發(fā)生發(fā)展過程中重要的炎性因子，同時血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1, HO-1）可抑制炎癥反應(yīng)。本實驗通過建立SAP大鼠模型，探討早期膽汁外引流對SAP大鼠炎性因子HMGB1和TNF-α以及抑制炎性因子HO-1表達(dá)的影響，從而達(dá)到調(diào)控炎癥，保護相關(guān)臟器的作用，進(jìn)而指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

54只健康清潔Wistar成年大鼠，雌性，體重190～200 g，由山東省朋悅公司提供；酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司提供）；牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司提供）。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（山東省千佛山醫(yī)院中心實驗室提供）；低速離心機（山東大學(xué)弘立醫(yī)學(xué)動物實驗公司提 供）。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗過程一 將54只健康清潔Wistar成年大鼠分成3組，每組大鼠各18只，假手術(shù)組（SOG組)、模型未引流組（SAP組)和模型引流組（BDG組）。構(gòu)建大鼠SAP模型：采取腹腔注射麻醉，取上腹部正中開腹，沿肝十二指腸韌帶找到膽總管后，暫時夾閉肝門部膽管，使用0.45號頭皮針頭于十二指腸外側(cè)壁（對系膜緣）穿孔，經(jīng)胰膽管逆行注射4%?；悄懰徕c（0.1 ml/100 g），逐層關(guān)腹，術(shù)后大鼠繼續(xù)禁食，自由飲水。SAP組與BDG組均構(gòu)建大鼠SAP模型，BDG組大鼠行早期膽汁外引流處理；SOG組只行開腹手術(shù)。

1.3.1 實驗過程二 實驗結(jié)束后立即行開腹手術(shù)，在無菌條件下抽取下腔靜脈血液3～4 ml，室溫放置2 h后，1 000 g離心20 min，取上清；應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-α、HO-1以及HMGB1的表達(dá)和含量：取出ELISA試劑盒板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μl（TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次是240、160、80、40、20和0 pg/ml；HO-1標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次是1 800、1 200、600、300、150 和 0 pg/ml；HMGB1標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次是：12、8、4、2、1和0 μg/L），樣本孔加入待測樣本50 μl，空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase, HRP）標(biāo)記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液350 μl，靜置1 min；甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；洗板完成后，每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔吸光度（optical density, OD）值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其OD值繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品實際濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組計量資料組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），其中組間兩兩數(shù)據(jù)比較采用Dunnet-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對象TNF-α水平比較

建模成功后第3、6和12小時SAP組TNF-α水平均顯著高于SOG組（P＜0.05） ；建模成功后第3、6和12小時，SAP組與BDG組TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 3組研究對象HMGB1水平比較

建模成功后第3、6和12小時，SAP組與SOG組HMGB1水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；建模成功后第3和12小時，SAP組與BDG組HMGB1水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；建模成功后第6小時，SAP組與BDG組HMGB1水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 3組研究對象HO-1水平比較

建模成功后第3、6和12小時BDG組HO-1水平均顯著高于SAP組（P＜0.05）；建模成功后第3、6和12小時，SAP組與SOG組HO-1水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表1 3組研究對象建模成功后不同時間點TNF-α水平比較 （±s, pg/ml）

表1 3組研究對象建模成功后不同時間點TNF-α水平比較 （±s, pg/ml）

注：1）與SOG組比較，t =40.195，29.193，40.202；P =0.000，0.000，0.000。2）與SAP組比較，t =7.061，7.310，8.539；P =0.000，0.000，0.000。

組別 例數(shù) 3 h 6 h 12 h SOG 組 6 86.83±1.29 106.91±3.44 103.69±1.11 SAP 組 6 216.31±8.461） 267.57±13.061） 215.95±6.751）BDG組 6 189.59±5.472） 226.77±4.392） 187.87±4.392）

表2 3組研究對象建模成功后不同時間點HMGB1水平比較 （±s, pg/ml）

表2 3組研究對象建模成功后不同時間點HMGB1水平比較 （±s, pg/ml）

注：1）與SOG組比較，t =14.203，13.014，8.520；P =0.000，0.000，0.000。2）與SAP組比較，t =0.172，11.669，0.549；P =0.867，0.000，0.595。

組別 例數(shù) 3 h 6 h 12 h SOG組 6 9.90±0.0.76 9.45±0.81 9.62±0.0.36 SAP 組 6 15.81±0.661） 17.5±0.411） 15.85±0.751）BDG組 6 15.75±0.572） 14.31±0.522） 15.64±0.0.682）

表3 3組研究對象建模成功后不同時間點HO-1水平比較 （±s, pg/ml）

表3 3組研究對象建模成功后不同時間點HO-1水平比較 （±s, pg/ml）

注：1）與SOG組比較，t =9.247，11.884，21.355；P =0.000，0.000，0.000。2）與SAP組比較，t =4.847，14.738，32.106；P =0.002，0.000，0.000。

組別 例數(shù) 3 h 6 h 12 h SOG 組 6 2 061.13±67.61 2 074.95±19.33 1 945.52±20.89 SAP 組 6 2 376.99±95.021） 2 232.38±66.851） 1 689.19±20.691）BDG組 6 2 588.84±49.282） 2 664.09±26.052） 2 303.44±42.042）

3 討論

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是由多種原因促使胰酶異常激活的胰腺急性進(jìn)程的炎癥疾病,其中膽源性和酒精所致的急性胰腺炎在臨床中比較常見[1]。急性重癥胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）的特點是胰腺組織壞死感染合并持續(xù)性的器官衰竭，而SAP全身炎性反應(yīng)是其全身性炎性病變的基礎(chǔ)[2]。HMGB1是一種新型的炎性細(xì)胞因子，既往研究已經(jīng)證實HMGB1與SAP的發(fā)生與嚴(yán)重程度相關(guān)[3]。本研究結(jié)果顯示，建模成功后第3、6和12小時，SAP組HMGB1水平均高于SOG組（P＜0.05），本結(jié)果也證實了上述觀點。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor of advanced glycation end products, RAGE）是HMGB1的主要受體，RAGE與HMGB1具有高度親和力[4]，兩者結(jié)合后可同時激活兩條下游信號途徑：一條是Ras和NF-κB途徑，其涉及炎癥和應(yīng)激反應(yīng)；另一條Rac和cdc42途徑，其與細(xì)胞的運動性和神經(jīng)軸突生長有關(guān)[5]。Park等[6]證實HMGB1可與膜受體結(jié)合激活Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥通路，使下游NF-κB表達(dá)增加，引起瀑式炎癥反應(yīng)，并且HMGB1參與膿毒癥的致死效應(yīng)，且該細(xì)胞因子出現(xiàn)較晚且持續(xù)時間更長[7]。TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,其被證實在SAP發(fā)病機制中起重要作用，其可使NF-κB活化，進(jìn)一步引起一系列炎癥反應(yīng)[8-10]。本研究顯示，建模成功后第3、6和12小時SAP組TNF-α水平均顯著高于SOG組（P＜0.05），以上證實了TNF-a與SAP的嚴(yán)重程度有關(guān)。HO-1是HO的亞型，其作為一種熱休克蛋白-32，可通過抵抗細(xì)胞的凋亡和氧化從而改善機體微循環(huán)[11-12]。HO-1可催化血紅素，使血紅素正中位α碳鏈斷裂,產(chǎn)生等摩爾的膽綠素、亞鐵離子（Fe2+）和一氧化碳（CO），這3種代謝產(chǎn)物都具有抗氧化，減緩組織損傷的功能，當(dāng)機體受到細(xì)胞因子、一氧化氮（NO）以及低氧等刺激產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時，HO-1表達(dá)升高，一定程度上是通過血紅素代謝產(chǎn)物從而發(fā)揮抗炎作用[13]。本實驗結(jié)果顯示，建模成功后第3、6和12小時BDG組HO-1水平均顯著高于SAP組（P＜0.05）；而SAP組HO-1水平隨時間的延續(xù)呈下降趨勢。以上結(jié)果提示SAP組炎癥程度呈增高趨勢，并且HO-1表達(dá)的增加可抑制SAP的炎癥反應(yīng)。

當(dāng)前對重癥急性胰腺炎的研究主要集中于液體復(fù)蘇和抑制胰液中胰酶釋放等應(yīng)用方面，對于早期膽汁外引流延緩SAP的進(jìn)程尚缺乏理論依據(jù)。臨床中，以內(nèi)鏡鼻膽管引流（endoscopic nasobiliary drainage, ENBD）、內(nèi)鏡膽管支架內(nèi)引流（endoscopic retrograde biliary drainage, ERBD）為主的膽汁外引流治療方式，具有操作簡單、創(chuàng)傷小、效果明顯、并發(fā)癥少且費用低等優(yōu)點[14]。有研究證實，SAP患者行膽汁引流術(shù)后，相關(guān)炎癥因子淀粉酶等胰腺炎指標(biāo)及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平明顯降低。Liu等[15]研究證實失血性休克大鼠和內(nèi)毒素休克大鼠行“膽汁外引流”后，大鼠的存活時間均顯著延長，同時其腸道的病理損傷顯著減輕。相關(guān)文獻(xiàn)報道，休克以及膿毒血癥患者或動物模型膽汁中含有多種炎性細(xì)胞，如TNF-α、HMGB1以及NF-κB等炎性因子，當(dāng)膽汁引流使炎性細(xì)胞流出體外，并使炎性細(xì)胞含量降低，從而緩解患者或?qū)嶒瀯游锏难装Y狀況[16-18]。本實驗通過建立SAP大鼠模型，行早期膽汁外引流，第3、6和12小時BDG組HMGB1、TNF-a水平均低于SAP組（P ＜0.05），證實了早期膽汁外引流確實可以減少SAP大鼠血清中炎性因子的表達(dá)，調(diào)控炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減緩SAP的進(jìn)程，起到保護相關(guān)臟器的作用。

綜上所述，早期膽汁外引流可調(diào)控SAP患者炎癥反應(yīng)，為ENBD和ENRD在SAP患者的臨床應(yīng)用中提供了一定的理論依據(jù)，也為臨床中尋求更多減緩胰腺炎炎癥進(jìn)程和促進(jìn)機體機能快速恢復(fù)方法做出了貢獻(xiàn)。

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