黃葉紅，陽敏，彭博，李俊輝，劉洪，莊權(quán)，吳翔，舒衡平，明英姿

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院 寄生蟲教研室，湖南 長沙 410078；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院器官移植中心，湖南 長沙 410013）

蠕蟲作為一類古老的寄生蟲，在漫長的進化過程中，獲得了獨特的免疫調(diào)節(jié)能力，能夠逃逸宿主的免疫反應(yīng)，與宿主形成了一種“共生”狀態(tài)[1-3]。日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）是蠕蟲的一種，廣泛分布于我國長江流域。大量研究表明，血吸蟲可溶性蟲卵蛋白（soluble egg antigen, SEA）具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。1996年，Ramaswamy等[4]首先從曼氏血吸蟲分泌物中分離出一種蛋白質(zhì)，分子量約為16 kDa，命名為Sm16。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Sm16能抑制抗原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增生和白介素-2（interleukin-2, IL-2）生成，從而抑制宿主的免疫反應(yīng)。2009年，吳忠道等[5]首次從日本血吸蟲中獲得了類似的蛋白成分，命名為Sj16蛋白。經(jīng)檢測，Sj16核苷酸序列與Sm16有99%的相似度，蛋白序列相似度達(dá)到100%。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，Sj16對不同抗原誘發(fā)的適應(yīng)性免疫具有明顯的下調(diào)作用，其表現(xiàn)為減少相應(yīng)抗體的產(chǎn)生和IL-12的合成，抑制Th1的反應(yīng)和MHC II的表達(dá)[6]。Sj16蛋白存在一個功能性的核苷酸N端，可以抑制LPS誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DCs）的成熟，并促進DCs IL-10的釋放[7]。rSj16通過抑制PPRA-α信號通路對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的腸炎具有保護作用，這為治療炎癥性腸病提供一種新方案[8]。這說明Sj16蛋白同樣具有免疫調(diào)節(jié)的功能。

Sj16的免疫調(diào)節(jié)功能在器官移植免疫中的作用令人期待。然而，我們在合成Sj16蛋白時發(fā)現(xiàn)，其可溶性并不理想，嚴(yán)重影響了Sj16在體內(nèi)的吸收和功能。Martin Gullberg等通過對Sm16蛋白結(jié)構(gòu)的深入研究，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中第92位的異亮氨酸（Ile-92）和第93位的亮氨酸（Leu-93）是影響其可溶性的重要位點；將它們進行突變后，可溶性大大增加[9]。因此，在本實驗中，我們對Sj16蛋白序列進行了優(yōu)化，以增強Sj16AA的表達(dá)，提高其可溶性，為進一步應(yīng)用于器官移植免疫研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌種 PUC-sp質(zhì)粒（上海生工）、pMal-c2X質(zhì) 粒（New England Biolabs, NEB）、BL21/DE3菌為本室保存的。

1.1.2 主要試劑 Quick-Fusion無縫克隆試劑盒（Biotool），EcoR I、Sal I限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA marker和逆轉(zhuǎn)錄酶（為上海拜朗生物公司產(chǎn)品）、Taq DNA聚合酶、dNTP（TaKaRa）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG（Proteintech）；抗MBP抗體（Proteintech）；氨芐青霉素（北京鼎國昌盛生物科技有限公司）、IPTG（BioFroxx）、PCR產(chǎn)物膠純化回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒（OMEGA）。

1.2 方法

1.2.1 Sj16AADNA模板的設(shè)計和合成 在Sj16 DNA序列的基礎(chǔ)上[5]，將Ile-92、Leu-93的密碼子序列更改為丙氨酸（Ala）密碼子GCG，并針對大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進行密碼子優(yōu)化。同時，在上游引入EcoR I酶切位點GAATTC，下游引入Sal I酶切位點GTCGAC。所得DNA序列由上海生工公司在PUC-sp質(zhì)粒中合成。全長序列：GAATTCA TGAAAGTTACCCCGATCATCTTCGCGGTTTTCTGC GTTGTTGGCGCGATGACCCTGATCACCGCGACGA CCCTGGAACAGGCGCCGCACCCGAGCGAAAAAG ACATGGAACTGGTGTACATCGACGCGGAATACGA AAAAGAAGGCGGCCTGAAGAGCATCTGCAACGAA ATCAAAAGAAGCTTCCGTAAAGGCCGTCACCACA TCTACAAAGTTATGGATAAATACATCCGCAAAGA AGACCTGGGCATGAAAATGCTGGACGTGGCGAAA GCGGCGGGCCGTCGTATCGAAAAACGTATGGAAT ACATCGCGAAAAAACTGGACAAAATGATGGAATA CGAAAGCAGCGTCGAC。

1.2.2 PCR引物的設(shè)計 根據(jù)Quick-Fusion無縫克隆試劑盒的要求及表達(dá)載體pMal-c2X的圖譜，采用Primer Premier 5.0軟件分析基因序列，設(shè)計特異性引物。基因引物設(shè)計如下：正義引物：GA GGGAAGGATTTCAGAATTCATGAAAGTTACC，反義引物：CAAGCTTGCCTGCAGGTCGACGCTGCTTT CGTA

1.2.3 Sj16AA基因的PCR擴增及Sj16AA基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以構(gòu)建到PUC-sp載體上的日本血吸蟲蛋白Sj16AA全長基因為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件 ：94℃，5 min ；（98℃，10秒，55℃，5秒，72℃，20秒）循環(huán)30次；72℃，7 min；4℃，終止。擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳回收目的片段。

將pMal-c2X載體通過限制性內(nèi)切酶EocR I和Sal I酶切后得到線性化載體，采取Quick-Fusion無縫克隆試劑盒在37℃融合30 min實現(xiàn)載體和PCR產(chǎn)物的融合，獲得Sj16AA基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒pMal-c2X-Sjl6AA，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli DH-5α。再進行涂板，挑單克隆菌液進行PCR驗證；PCR陽性克隆行基因測序驗證。

1.2.4 重組的Sj16AA基因在大腸桿菌中的表達(dá)和鑒 定 取70 μl陽性克隆驗證中呈陽性的菌液加入到含有0.1%氨芐抗性的7 ml LB液體培養(yǎng)液中（1∶100接種），用50 ml離心管37℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)4 h，在不同濃度的IPTG（0 mmol/ L，0.1 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L） 和 不 同 溫度（37℃、32℃、28℃、16℃）下，200 rpm誘導(dǎo)10～13 h。將上述菌液6 000 rpm，4℃，離心10 min，棄上清。每管菌加400 μl PBS（pH 7.3）重懸，按1∶100的比例加入PMSF（100 mmol/L），渦旋振蕩混勻，100℃煮沸10 min。沉淀用120 μl 8 mol/L尿素溶解，加入40 μl 4×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）混合。SDS-PAGE檢驗蛋白表達(dá)情況。條件：130 V，90 min跑膠。卸膠后用考馬斯亮藍(lán)染色液染色4～5 h，過夜脫色，之后每隔一段時間更換脫色液，直至背景色脫干凈。

1.2.5 Western-blot鑒定 將凝膠置BIO-RAD轉(zhuǎn)移電泳裝置進行，300 mA，4℃下轉(zhuǎn)膜1 h。麗春紅染膜后觀察結(jié)果，洗膜后用5%脫脂奶粉PBST封閉1 h。將抗MBP抗體以1∶1 000稀釋，過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 1∶1 000稀釋，底物顯色系統(tǒng)為DAB-H202。

2 結(jié)果

2.1 PCR獲得日本血吸蟲蛋白Sj16AA基因

以構(gòu)建到PUC-sp質(zhì)粒上的日本血吸蟲蛋白Sj16AA全長基因為模板，用設(shè)計的基因特異性引物進行PCR結(jié)果如下（見圖1），全長基因大約為363 bp，初步證明目的片段已被正確擴增。

圖1 Sj16基因的PCR擴增結(jié)果

2.2 Sj16AA蛋白最佳表達(dá)條件的確定

2.2.1 誘導(dǎo)溫度對融合蛋白表達(dá)的影響 與誘導(dǎo)溫度28℃、30℃、32℃或37℃相比，16℃誘導(dǎo)時可溶性MBP-Sj16（58 kDa）的表達(dá)比例明顯升高 ；當(dāng)溫度高于16℃時，隨著溫度的升高，MBPSj16可溶性下降，主要以包涵體形式存在（見圖2）。因此，本研究將16℃作為優(yōu)化后的誘導(dǎo)溫度。

圖2 不同溫度誘導(dǎo)條件下SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果

2.2.2 誘導(dǎo)劑濃度對MBP-Sj16表達(dá)的影響 誘導(dǎo)劑濃度影響融合蛋白的表達(dá)，為了探究最佳誘導(dǎo)劑濃度，本研究設(shè)置了不同的誘導(dǎo)劑IPTG濃度梯度 ：0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/ L。比較不同誘導(dǎo)劑濃度下的可溶性蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IPTG為0.5 mmol/L時可溶性蛋白比例明顯高于其他組別（見圖3）。

圖3 不同誘導(dǎo)劑濃度條件下SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果

2.3 Western-blot驗證Sj16AA蛋白的表達(dá)

在可溶性MBP-Sj16的優(yōu)化后的表達(dá)條件下，擴大搖菌體積為1.5 L，當(dāng)OD值為0.6時，進行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG濃度為0.5 mmol/L，16℃溫度下誘導(dǎo)表達(dá)13 h。收集菌體后超聲破碎細(xì)菌，收集上清進行融合蛋白驗證和純化。pMal-c2X轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)后出現(xiàn)一分子量約為42 kDa明顯表達(dá)帶，此為MBP蛋白；pMal-c2X轉(zhuǎn)化的BL21/DE3菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，較誘導(dǎo)前于約58 kDa出現(xiàn)一條明顯的融合蛋白表達(dá)條帶（見圖4）。免疫印跡分析，pMal-c2X轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)于約58 kDa處有一條帶為pMal-c2X轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)MBP-Sj16蛋白能特異地被抗MBP抗體識別（見圖5）。

圖4 融合蛋白純化后SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果

圖5 MBP-Sj16的Western Blot驗證

3 討論

血吸蟲病是熱帶和亞熱帶地區(qū)主要的寄生蟲病之一，目前全球大約有2億人感染，每年死亡人數(shù)超過28萬，由于血吸蟲能夠在宿主血管內(nèi)生活數(shù)十年，其能夠逃逸宿主的免疫反應(yīng)。因此，血吸蟲病已成為寄生蟲乃至免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[1]。在我國血吸蟲流行的是日本血吸蟲，大量研究表明血吸蟲的確具有免疫調(diào)節(jié)的功能[6,9-10]。2009年，南京醫(yī)科大學(xué)汪雪峰等發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲蟲卵和成蟲中提取的熱休克蛋白60相關(guān)的蛋白SJMHE1可誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，輸注這類Treg可有效緩解小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[11]。2013年，季旻珺等發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲可溶性蟲卵蛋白（soluble egg antigen, SEA）可以與抗原遞呈細(xì)胞，尤其是樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DCs）表面的Toll樣受體2（toll like receptor 2,TLR2）結(jié)合，從而誘導(dǎo)程序性壞死配體（programmed death ligand 1, PD-L1）和PD-L2的表達(dá)增加，致使表達(dá)程序性壞死因子（programmed death, PD）的CD4+T細(xì)胞死亡，從而起到免疫抑制作用[12]。最近，吳忠道等發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲SEA誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生的外泌體中攜帶的抗炎信號可有效地緩解硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)[13]。如前所述，日本血吸蟲SEA可以有效誘導(dǎo)免疫抑制或耐受，但SEA是一個由多種抗原組成的復(fù)合物，其作用靶點與機制可能并不單一，會給研究帶來困擾，阻礙其在臨床上的推廣。

為了解決這一問題，大量研究致力于尋找一種單一的日本血吸蟲蟲卵蛋白來替代SEA。1996年，研究發(fā)現(xiàn)從曼氏血吸蟲尾蚴的分泌物中提取出一種16 kDa蛋白，命名為Sm16，后續(xù)的體外功能實驗中發(fā)現(xiàn)，Sm16不僅能夠下調(diào)角質(zhì)細(xì)胞中白介素1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist, IL-1ra）的表達(dá)，而且能抑制內(nèi)皮細(xì)胞中淋巴細(xì)胞增生和細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）的表達(dá)[4]。2009年，Gobert等發(fā)現(xiàn)Sj16的mRNA主要存在于尾蚴和童蟲。同年，來自香港中文大學(xué)和中山大學(xué)的科學(xué)家們從日本血吸蟲尾蚴中提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，基于Sm16的核苷酸序列設(shè)計了Sj16的引物，最終擴增最先合成了Sj16蛋白，經(jīng)檢測，克隆得到的Sj16核苷酸序列與Sm16有99%的相似度，蛋白序列相似度達(dá)到100%[5]。進一步研究發(fā)現(xiàn)重組的日本血吸蟲Sj16蛋白具有較好的免疫調(diào)節(jié)功能，其存在一個功能性的核苷酸N端，其可抑制不同抗原誘發(fā)的適應(yīng)性免疫，阻礙LPS誘導(dǎo)的DCs的成熟過程，并促進DCs IL-10的釋放，通過抑制PPRA-α信號通路減輕腸道炎癥反 應(yīng)[6-8]。

Ramaswamy等[14]最先在大腸桿菌和桿狀病毒體系中表達(dá)蛋白Sm16，盡管可以間接驗證表達(dá)成功，但無法得到足夠純化的和可溶的重組Sm16蛋白。在1999年，Valle等[15]在細(xì)菌、酵母和昆蟲體系中嘗試表達(dá)SmSLP（stathmin-like protein），其產(chǎn)量都非常低。這些研究表明原核或真核表達(dá)體系來表達(dá)出高產(chǎn)量和可溶性高的Sm16蛋白是非常困難的。2009年，為合成可溶性高和純化的Sm16蛋白，Martin Gullberg等對其Sm16氨基酸序列修飾及密碼子優(yōu)化，降低肽鏈的聚合性，減少疏水性，從而促進其表達(dá)和純化，并具有較好的可溶性；同時，優(yōu)化的蛋白，其免疫調(diào)節(jié)功能并未受影響[9]。筆者嘗試借鑒他們的方法對Sj16氨基酸序列進行改造，在設(shè)計新的Sj16蛋白的核苷酸序列時，將第92位的異亮氨酸（Ile-92）和第93位的亮氨酸（Leu-93）對應(yīng)的密碼子更換為丙氨酸（Ala）的密碼子，通過減少肽鏈的聚集性，降低其疏水性，增加Sj16AA蛋白的可溶性。此外，由于Sj16核苷酸序列中含有部分密碼子對大腸桿菌來說屬于稀有密碼子，筆者對其進行了優(yōu)化，以提高Sj16AA蛋白的表達(dá)。

在大腸桿菌中，當(dāng)外源蛋白高水平表達(dá)的時候，極易形成包涵體，為蛋白純化等下游工作帶來很大的麻煩。因此，應(yīng)設(shè)法使目的蛋白以可溶形式表達(dá)的越多越好，即增強蛋白的可溶性表達(dá)，通常的策略有降低蛋白合成的速度、改變培養(yǎng)基、與分子伴侶或折疊酶共表達(dá)及使用特定的菌株等。本實驗以低溫低IPTG長時間誘導(dǎo)的方法（16℃，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)10～13 h），成功避免了包涵體形成，獲得了足夠量的可溶性蛋白。同時，采用了pMal-c2X質(zhì)粒，該質(zhì)粒在編碼蛋白的N端帶有MBP融合標(biāo)簽，可以用抗MBP抗體來檢測蛋白的表達(dá)情況。并引入了切除MBP的蛋白酶切位點，方便后續(xù)實驗中切除MBP。

通過筆者課題組的努力，成功地克隆了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pMal-c2X-Sj16AA并進行了原核表達(dá)，獲得了較純化的且可溶性較高的Sj16蛋白，已將其應(yīng)用于動物實驗，取得了較理想的效果，經(jīng)優(yōu)化的Sj16蛋白可以更好地應(yīng)用于移植免疫相關(guān)的臨床與基礎(chǔ)實驗。

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