梁柏瑩 宋玉美 郭松超 歐陽軼強

乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在廣西惡性腫瘤中位居第4位［1］，其形成是一個復雜的過程，多種因素參與其發(fā)生和發(fā)展，包括細胞增殖和凋亡紊亂、腫瘤基質和腫瘤周圍血管形成等。這些因素又受到多種因子調控，其中細胞因子對腫瘤的作用越來越受到重視。?；撬崾侨梭w中最豐富的游離氨基酸，對人類健康的影響可延伸至整個生命周期。近年來，人們發(fā)現?；撬嵩谌橄侔┑念A防和治療中具有重要的應用價值。本研究通過建立7，12-二甲基苯蒽（7，12-dimethyl benzene［a］anthracene，DMBA）誘發(fā)乳腺癌動物模型，觀察牛磺酸對誘癌作用的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMBA，化學式：C20H16，分子量：256.34，CAS登錄號：57-97-6，EINECS登錄號：200-359-5，購于美國sigma公司。?；撬幔撼Ｅ剖称诽砑觿┡；撬幔ň幪枺篏B14759-2010）；食用花生油，大鼠白介素6（IL-6）酶聯免疫試劑盒（編號：CSB-E04640r）和大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫試劑盒（編號：CSB-E11987r）購自武漢華美生物工程有限公司。

1.2 實驗動物及分組

6周齡SD雌性大鼠30只，健康未育，平均體重約180 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供（實驗動物生產許可證號SCXK桂2014-0002）。飼養(yǎng)于SPF級實驗室（實驗動物使用許可證號SYXK桂2014-2003）。按標準飼料（廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）喂養(yǎng)，自由飲水，適應1周后隨機分為?；撬岣深A組、模型對照組、空白對照組，每組10只，3組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠實驗開始時，?；撬岣深A組和模型對照組大鼠均按體重予15mg/100 g的DMBA，DMBA溶于花生油中，濃度為15mg/mL。同時，在?；撬岣深A組的飲水中添加3%牛磺酸［2-3］，一次性灌胃；空白對照組按體重予以1mL/100g花生油灌胃。

1.3.2 標本采集至第21周終止實驗。實驗結束時未長瘤大鼠取第2、3對乳腺，用電動理發(fā)器將乳頭周圍約1 cm范圍毛剃除，將乳腺連同周圍皮膚、皮下組織切除，自乳頭部對半切開乳腺。用福爾馬林將腫瘤組織及乳腺組織固定、脫水及石蠟包埋，組織切片后，HE染色觀察大鼠乳腺或瘤體細胞形態(tài)變化，篩查乳腺癌的發(fā)生率，乳腺病理診斷標準參考《WHO腫瘤分類》，采集腹腔靜脈血備用。

1.3.3 觀察指標灌胃后，每2天對大鼠乳腺進行觸診，觀察大鼠乳腺腫瘤生長情況，記錄腫瘤出現的時間，計算各組大鼠體重、致瘤率、荷瘤總數、腫瘤發(fā)生的潛伏期等。標本采集后取?；撬岣深A組、模型對照組大鼠乳腺腫瘤，測量腫瘤的長徑（a）和縱徑（b），計算腫瘤體積（V）［4］：V=π/6ab2，同時測量腫瘤重量。

1.3.4 免疫指標的檢測采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠血清IL-6和TNF-α水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，計量資料若服從正態(tài)分布，則使用均數±標準差（x±s）描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若整體差異有統(tǒng)計學意義，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗；計量資料若不服從正態(tài)分布則采用中位數（四分位數間距）描述，組間比較采用秩和檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

給藥后第2周和第5周，?；撬岣深A組、模型對照組兩組大鼠各死亡1只，尸檢未發(fā)現任何腫瘤，死亡原因不明。見表1。

2.2 大鼠腫瘤發(fā)生情況

給藥后第7周，在模型對照組首次觸及瘤塊；第9周，在?；撬岣深A組首次觸及瘤塊空白對照組至實驗結束均未觸及瘤塊。至第21周終止實驗，與模型對照組相比，牛磺酸干預組腫瘤發(fā)生的潛伏期延長，致瘤率、荷瘤總數均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；腫瘤體積和重量增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1和圖1。給藥后?；撬岣深A組、模型對照組大鼠致瘤率隨時間變化情況顯示，在觀察期內，大鼠的腫瘤出現時間不一致，模型對照組的致瘤率始終高于?；撬岣深A組，且?；撬岣深A組在第17周后不再出現新荷瘤大鼠，而模型對照組荷瘤大鼠持續(xù)增加，見圖2。至21周，模型對照組大鼠總荷瘤數遠大于牛磺酸干預組，見圖3。腫瘤經病理切片HE染色證實為乳腺癌，說明大鼠乳腺癌模型造模成功。大鼠乳腺組織正常的結構被破壞，腺上皮細胞呈單層或多層排列，細胞核大小不等，染色質深，核仁明顯，可見核分裂相，見圖4。

表1 大鼠一般情況及腫瘤生長情況

圖1 實驗結束時各組大鼠乳腺腫瘤生長情況

圖2 給藥后牛磺酸干預組、模型對照組大鼠乳腺癌致瘤率隨時間的變化情況

圖3 給藥后?；撬岣深A組、模型對照組大鼠荷瘤總數隨時間的變化情況

圖4 大鼠乳腺腫瘤組織病理切片（HE染色，×400）

2.3 ?；撬釋Υ笫笱逯蠺NF-α和IL-6水平的影響

與模型對照組相比，?；撬岣深A組血清IL-6和TNF-α水平均明顯下降（P<0.05）；與空白對照組相比，模型對照組血清IL-6和TNF-α水平明顯升高（P<0.05），牛磺酸干預組升高不明顯（P>0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α及IL-6的水平

3 討論

采用DMBA誘導大鼠乳腺癌是較為成熟的實驗方法［5-6］。本實驗再次證明DMBA對乳腺的高特異性及強致癌性，與Mundhe等［7］研究結果一致。近十年，?；撬嵊糜诎┌Y防治的研究越來越多，亦取得較好成果。El Agouza等［8］研究發(fā)現，漸進性抑制細胞凋亡和誘導血管生成可能有助于腫瘤形成、生長和轉移。有研究采用不同濃度的?；撬崽幚砣私Y直腸癌細胞，發(fā)現?；撬峥赏ㄟ^上調PUMA表達和提高Bax/Bcl-2比率，抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［9］。在癌癥治療中，化療耐藥性一直是研究的重點。研究［10］發(fā)現姜黃素（CUR）、黑枯茗（NS）和?；撬嶂委熆筛纳埔劳胁窜赵贛CF-7、HepG2、U251、HeLa和HCT116等細胞中的細胞毒副作用，增強腫瘤細胞對依托泊苷的敏感性，減少依托泊苷用量可降低治療的毒副作用。同時有研究發(fā)現，姜黃素和?；撬崧摵现委煂甭怨撬璋籽』颊叽嬖跐撛诏熜А１狙芯客ㄟ^設立?；撬岣深A組，給予?；撬岣深A組大鼠的日常飲水中添加3%的?；撬?，21周后終止實驗。與模型對照組相比，?；撬岣深A組致瘤率下降，腫瘤發(fā)生的潛伏期延長，此外，?；撬岣深A組多為單發(fā)瘤，而模型對照組均為多發(fā)瘤，其最少荷瘤數為2個，最多達8個，牛磺酸干預組大鼠荷瘤總數顯著低于模型對照組，表明牛磺酸可有效延遲并抑制乳腺癌的發(fā)生，降低乳腺癌形成過程對機體造成的損害。但?；撬岣深A組、模型對照組平均腫瘤體重和腫瘤體積差別不顯著，表明牛磺酸對大鼠乳腺癌的生長抑制作用不明顯。

流行病學研究發(fā)現，由炎癥引起的腫瘤占15%左右［11］，單個腫瘤細胞可通過細胞增殖和抑制細胞凋亡兩種機制形成多細胞的原發(fā)性腫瘤，而以上兩種機制均可由炎癥刺激誘導［12］。TNF-α是炎癥的主要介質之一，是內源性腫瘤啟動子［13］。在正常情況下，TNF-α具有抗感染和抗腫瘤作用，但持續(xù)釋放或釋放過多又會引起機體產生一系列的病理變化，在一些炎癥反應和腫瘤的發(fā)生中起十分重要的作用。本研究結果顯示，在?；撬岣深A組大鼠日常飲水中添加3%的牛磺酸可有效降低血清TNF-α水平，提示在乳腺癌形成初始，牛磺酸可能通過抑制由新生腫瘤細胞誘導的單核-巨噬細胞和中性粒細胞活化，并抑制其大量釋放TNF-α，減輕機體炎癥反應，進而抑制腫瘤形成。IL-6具有腫瘤生長因子活性，能促進腫瘤細胞生長繁殖，并具有直接的免疫抑制作用，可抑制機體免疫系統(tǒng)抗腫瘤作用的發(fā)揮，促進腫瘤細胞在宿主體內生長、繁殖和侵襲［14］，而機體TNF-α水平異常增高可介導腫瘤細胞分泌大量IL-6。本研究?；撬岣深A組大鼠血清中IL-6水平亦顯著降低，說明?；撬岣深A可能使大鼠血清中IL-6水平降低，從而抑制乳腺癌細胞生長繁殖。

本研究結果顯示，?；撬嵋种迫橄侔┑臋C制可能通過抑制大鼠血清中TNF-α和IL-6水平異常升高，降低炎癥反應，維持大鼠機體正常的免疫機制，從而促進機體抗腫瘤作用。

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