陳 晉，吳常文，張建設(shè)，周 超

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022)

隨著沿海地區(qū)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和海洋資源的開發(fā)利用，海洋污染日益嚴(yán)重，其中Cu2+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子在海水中的含量不斷上升，重金屬成為海洋的主要污染物。重金屬污染物會對海洋生物造成持續(xù)不可逆的傷害，積累到一定限度更會危害到海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，或經(jīng)過食物鏈間接危害到人類健康。海洋微藻作為海洋主要的初級生產(chǎn)者，是海洋食物鏈的基礎(chǔ)和起點。相較于海洋食物鏈中高營養(yǎng)級的生物，海洋微藻對重金屬污染應(yīng)激反應(yīng)更為敏感。因此開展重金屬對海洋微藻的毒害作用研究，對于建立相應(yīng)的污染物監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)具有重要重要現(xiàn)實意義。

近年來，有關(guān)重金屬對海洋微藻毒害作用的研究已初見報道[1-2]。傳統(tǒng)重金屬毒害作用研究，通常集中于重金屬半致死濃度(LC50)或者半抑制濃度(EC50)[3]以及該濃度脅迫下藻類相應(yīng)的生理生化反應(yīng)研究[4-5]。由于重金屬在海洋中的濃度是常低于國標(biāo)濃度，并保持長期低濃度刺激海洋生態(tài)系統(tǒng)，因此從低限值持續(xù)刺激角度切入，探究重金屬污染對海洋生物的影響，對于完善海洋重金屬污染的毒性脅迫機理具有重要作用。鋅在生物體中起著雙重作用，既是生物代謝必需的微量營養(yǎng)元素，又是一種一定濃度下具高毒性的重金屬。有關(guān)鋅對藻類生長的影響已有不少研究[1-4]，而關(guān)于重金屬低限值持續(xù)刺激下海洋微藻的毒性研究還鮮見報道。硅藻是一類重要的真核浮游生物，其光合產(chǎn)量占據(jù)海洋初級生產(chǎn)力的40%[6]，具有重要的生態(tài)學(xué)地位。三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum Bohlin作為硅藻門中1個重要種類，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常被用作生物餌料，同時也是一種常用的毒性監(jiān)測受試生物[3]。本文以硅藻-三角褐指藻為測試目標(biāo)，探究Zn2+不同脅迫方式對三角褐指藻生長繁殖以及光合作用的影響，旨在掌握不同的刺激方式對海洋浮游植物初級生產(chǎn)力的影響情況。

1 材料與方法

1.1 藻類來源

三角褐指藻藻種購買自上海光語生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)條件及試劑

培養(yǎng)用的錐形瓶經(jīng)10%稀HCl浸泡過夜后，用蒸餾水反復(fù)沖洗后滅菌備用；培養(yǎng)用海水為自然海水，經(jīng)自然沉淀后，用0.45 μm微孔濾膜抽濾經(jīng)充分曝氣消毒后使用。實驗過程中，藻類采用F/2培養(yǎng)基，于GXZ-208B型恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(寧波江南儀器廠)，其中光照強度為6 000 lx，溫度為20±2℃，光暗周期為 12 h：12 h。

實驗過程中添加的ZnCl2(AR分析純)為國藥生產(chǎn)，配制ZnCl2溶液的水采用超純水。實驗過程中添加的ZnCl2溶液濃度分別為5.000 mg/mL及0.500 mg/mL。鹽酸(HCl，AR分析純)為滬試生產(chǎn)，超純水稀釋到10%備用。

1.3 實驗方法

將10 mL對數(shù)生長期的三角褐指藻接種到裝有90 mL新鮮的F/2培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，起始藻液濃度為8×105cell/mL。實驗組分為2組：一組為強刺激組(high-dosage single exposure，HSE)，另一組為持續(xù)弱刺激組(low-dosage repeated exposure，LRE)，HSE組：加入20 μL濃度為5.000 mg/mL的ZnCl2溶液(體積比為0.02%)到培養(yǎng)基，使Zn2+最終濃度為1 mg/L，接近三角褐指藻的半抑制濃度(EC50)[3-4]；LRE組：每日加入20 μL濃度為0.500 mg/mL的ZnCl2溶液(體積比為0.02%)，每天2次持續(xù)5 d，5 d后最終使培養(yǎng)基中Zn2+的濃度達(dá)到與高濃度組相同的1 mg/L；空白對照組(CK)無ZnCl2添加，所有的試驗都設(shè)置3組平行試驗組，在恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。在暴露試驗過程中每日搖晃3～4次，防止藻細(xì)胞附壁沉降。

1.3.1 三角褐指藻種群增長曲線及生長速率的測定

三角褐指藻種群數(shù)量采用血細(xì)胞計數(shù)板法對三角褐指藻藻細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，其中生長速率(μ)采用以下公式[7]計算得到：

式中μ為生長速率，x1和x2分別代表培養(yǎng)時間為t1和t2時藻液的細(xì)胞濃度。

1.3.2 葉綠素a含量的測定

葉綠素a含量測定采用熱乙醇法[8]，取2 mL藻液，過GF/F濾膜后，-20℃冷凍過夜后取出迅速放入盛有95%的熱乙醇的離心管，蓋緊后80℃水浴2 min提取葉綠素。提取液經(jīng)超聲波振蕩10 min，暗處理4 h后，于15 000 r/min、4℃下離心5 min。取上清液于紫外分光光度計(UV-2700，島津)下，測定665 nm及750 nm處的吸光值，經(jīng)1 mol/L的鹽酸酸化后，再測得665 nm及750 nm處的吸光值。提取液中的葉綠素a濃度根據(jù)PORRA[9]的公式計算獲得：

其中：E665和E750為酸化前的吸光值；A665和A750為酸化后的吸光值；27.9為葉綠素a在乙醇相中吸光常數(shù)；V乙醇為乙醇相的體積；V樣品為樣品溶液的體積。

1.3.3 快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)測定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)測量采用浮游植物熒光儀(Phyto-PAM，Walz，德國)測定。每日取2 mL的三角褐指藻樣品經(jīng)暗適應(yīng) 5 min后，在最大飽和脈沖光照為 4 000 μmol/(m2·s1)下，測得 F0，F(xiàn)m，F(xiàn)v/Fm以及 rETR 的數(shù)值。

其中：F0為初始葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量(minimal fluorescence)；Fm為暗適應(yīng)后最大熒光產(chǎn)量(maximal fluorescence)；Fv=Fm-F0；Fv/Fm為PSII的光能轉(zhuǎn)換效率；rETR為相對光合電子傳遞率 (relative electron transport rate)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±S.E.)表示，差異顯著性設(shè)置P＜0.05。鋅脅迫濃度差異采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0.0(Chicago,USA)收集和統(tǒng)計原數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同暴露方式下重金屬Zn2+對三角褐指藻種群生長狀況的影響

三角褐指藻在重金屬Zn2+不同暴露方式下其種群生長情況如圖1所示。研究表明，對照組的三角褐指藻的生長曲線呈現(xiàn)典型的“S”型生長曲線，而HSE組和LRE組的三角褐指藻種群生長曲線出現(xiàn)明顯的差異(P＜0.05)。相較于對照組，在實驗早期(1～3 d)HSE組三角褐指藻種群生長速率顯著低于對照組和LRE組(P＜0.05)，從第4天開始進(jìn)入補償生長，生長速率逐漸恢復(fù)到對照組水平，第7天觀測結(jié)束時仍維持較高的生長速率。LRE組三角褐指藻種群在1～4 d里的生長狀況與對照組相近，第5天增速放緩，在第7天觀測結(jié)束時其種群密度顯著的低于HSE組(P＜0.05)。

重金屬Zn2+不同暴露方式下三角褐指藻種群增長速率如圖2所示，LRE組與空白對照組的種群增長趨勢一致，在第3天達(dá)到最大增長速率，并隨著時間的變化速率逐漸下降。而HSE組最大增長速率出現(xiàn)在第4天，此后迅速下降；觀測結(jié)束時，HSE組三角褐指藻種群增長速率與空白對照組及LRE組相差不大。

圖1 三角褐指藻種群數(shù)量隨時間變化圖Fig.1 The population of P.tricornutum changed over time

圖2 三角褐指藻種群增長速率隨時間變化圖Fig.2 The growth ratio of P.tricornutum changed over time

2.2 不同暴露方式下重金屬Zn2+對三角褐指藻葉綠素a含量的影響

三角褐指藻在重金屬Zn2+不同暴露方式下葉綠素a含量隨時間變化情況如圖3所示。空白對照組的葉綠素a含量隨時間變化不斷增加；HSE組的三角褐指藻葉綠素a含量隨著時間變化先緩慢下降并顯著低于空白對照組，第6天開始增長至正常水平，與空白對照組含量無顯著差別；LRE組的三角褐指藻葉綠素a含量隨著時間變化不斷下降，第5天開始顯著低于空白對照組。

2.3 不同暴露方式下重金屬Zn2+對三角褐指藻光系統(tǒng)II的影響

重金屬Zn2+不同暴露方式下對三角褐指藻PSII反應(yīng)中心最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)變化情況如圖4A所示。在整個暴露實驗過程中，空白對照組的Fv/Fm自第1天到第3天從52.8%增長到71.6%，此后持續(xù)的3 d時間內(nèi)在70%上下波動；而HSE組和LRE組之間并無顯著性差異，第3天開始兩個實驗組的Fv/Fm均要顯著低于對照組(P＜0.05)。從時間變化上來看，HSE組及LRE組并未呈現(xiàn)相關(guān)規(guī)律，二者在暴露實驗過程中其Fv/Fm均在62%之間上下波動。

重金屬Zn2+不同暴露方式下對三角褐指藻光合作用相對電子傳遞效率(rETR)如圖4B所示。相較于對照組，HSE組在受到大劑量重金屬Zn2+刺激下rETR抑制明顯，并隨著時間逐漸恢復(fù)到初期水平，最后第7天HSE組rETR要顯著高于LRE組(P＜0.05)。LRE組在暴露實驗初期rETR值緩慢上升并略高于對照組，但在暴露實驗第4天其rETR較前一天顯著下降并低于低于對照組的值(P＜0.05)，隨著重金屬Zn2+濃度不斷積累其rETR值也隨之不斷下降，并在第7天其rETR值顯著低于對照組及HSE組(P＜0.05)。

圖3 三角褐指藻葉綠素a含量隨時間變化圖Fig.3 The Chlorophyll a of P.tricornutum changed over time

圖4 三角褐指藻光系統(tǒng)II各參數(shù)(Fv/Fm、rETR)隨時間變化圖Fig.4 The Chlorophyll fluorescence parameters(Fv/Fm,rETR)of P.tricornutum changed over time

3 討論

3.1 HSE組重金屬Zn2+刺激對三角褐指藻的生物學(xué)效應(yīng)

HSE組所設(shè)置的Zn2+濃度為三角褐指藻的EC50[3-4]，高濃度的Zn不僅抑制相對光合電子傳遞效率而且使線粒體膜的功能性降低，葉綠素含量下降，最終影響藻類的生長[10]。在5 mg/L的重金屬Zn2+刺激下，暴露初期(1～3 d)三角褐指藻種群生長受到了顯著抑制，其葉綠素a含量及rERT也受到了不同程度的抑制作用。但在暴露實驗中后期(4～7 d)，HSE組三角褐指藻的種群生長和葉綠素a含量出現(xiàn)了類似“補償效應(yīng)”的增長，Zn2+對其抑制作用明顯弱化，種群數(shù)量及葉綠素a含量恢復(fù)到正常水平。該現(xiàn)象與三角褐指藻在N、P限制[11]以及UV脅迫[12]解除時出現(xiàn)的種群生增長狀況相似。推測有可能是微藻的吸附作用[13-14]或者代謝作用[5]降低了高濃度的重金屬Zn2+對三角褐指藻的毒害作用，進(jìn)而出現(xiàn)補償生長的現(xiàn)象，試驗結(jié)果需要進(jìn)一步驗證。另一方面根據(jù)HSE組的rETR雖然在暴露后期有所恢復(fù)但是其值仍顯著低于對照組這一現(xiàn)象，推測有可能高濃度的Zn2+已經(jīng)損傷細(xì)胞器，進(jìn)而影響光合作用。

3.2 LRE組重金屬Zn2+持續(xù)刺激對三角褐指藻的生物學(xué)效應(yīng)

LRE組設(shè)置的Zn2+濃度為0.5 mg/L為國標(biāo)[15]設(shè)置的水污染1.0 mg/L的一半，在重金屬Zn2+的5 d持續(xù)刺激下，在暴露早期(1～3 d)三角褐指藻種群生長與空白對照組無異葉綠素a含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)也隨之正常增長。這可能是由于Zn是微藻必需的微量元素之一，它對維持生命體的生長、代謝和酶活性等起著非常重要的作用。但隨著封閉的培養(yǎng)液體系中重金屬Zn2+的濃度不斷上升，最終達(dá)到HSE組設(shè)置的濃度5 mg/L，LRE組三角褐指藻種群提前進(jìn)入平臺期，其葉綠素a含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)在第4天前后開始下降。這與PAULSSON，et al[16]在G?ta ?lv流域研究藻類重金屬鋅的長期積累性毒害作用，亦發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，7 d時LRE組rETR值遠(yuǎn)低于對照組以及HSE組。研究表明，低濃度Zn2+污染(低于國標(biāo)水污染濃度)在海水中對三角褐指藻亦具有積累性毒害作用。

4 結(jié)論

本文比較了HSE和LRE兩種暴露方式下重金屬Zn2+對三角褐指藻的生態(tài)毒性效應(yīng)，結(jié)果表明HSE的脅迫方式在暴露起始階段對三角褐指藻的毒性表現(xiàn)最為明顯，并具有時效性；而LRE的脅迫方式在整個暴露實驗中在葉綠素a含量和PSII電子傳遞方面表現(xiàn)出顯著的積累性變化。研究發(fā)現(xiàn)，長期低濃度的重金屬Zn2+在水體中能造成三角褐指藻持續(xù)的毒害作用甚至造成細(xì)胞損傷，進(jìn)而影響光合作用。