陳 卓，施 慧，謝建軍，汪 瑋，王庚申，何 杰，許文軍

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

殺香魚假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida是引起大黃魚Pseudosciaena crocea內(nèi)臟白點(diǎn)病的病原，大黃魚一旦感染發(fā)病，在自然狀態(tài)下死亡率較高，是危害大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌。本實(shí)驗(yàn)室在養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)殺香魚假單胞菌還會(huì)感染黑鯛Acanthopagrus schlegelii、小黃魚Larimichthys polyactis等其它海水養(yǎng)殖魚類。研究表明殺香魚假單胞菌對(duì)多種水產(chǎn)常用抗生素類藥物有抵抗性，通過(guò)依賴藥物以控制該菌效果較差，也可能導(dǎo)致水產(chǎn)品中的藥物殘留進(jìn)而引起食品質(zhì)量安全問(wèn)題[1-4]。但是，近年隨著養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化，大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病在各大黃魚養(yǎng)殖區(qū)域廣泛爆發(fā)，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，已有不少學(xué)者對(duì)殺香魚假單胞菌的致病機(jī)理及相關(guān)的毒力因子展開研究，張丹楓等[5]對(duì)大黃魚進(jìn)行了人工感染實(shí)驗(yàn)與超微電鏡的觀察，從病理學(xué)角度展示了病原菌對(duì)魚內(nèi)臟組織的入侵與危害；張杰等[6]采用雙交換同源重組法構(gòu)建了殺香魚假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白ExsA突變株，從分子生物學(xué)角度闡述了該菌的致病機(jī)制，但殺香魚假單胞菌的致病機(jī)理至今尚不清楚。本文擬通過(guò)人工感染試驗(yàn)分析殺香魚假單胞菌在大黃魚各器官組織中的分布情況及其對(duì)組織產(chǎn)生的病理學(xué)變化來(lái)闡述病理?yè)p傷與病原分布的相互關(guān)系，為更深入的探討殺香魚假單胞菌致病機(jī)理以及疾病的防治提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

殺香魚假單胞菌ZS161211為本實(shí)驗(yàn)室分離和保存；健康大黃魚體重約40±3 g，購(gòu)自舟山臺(tái)門星鑫水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行細(xì)菌分離及寄生蟲觀察確認(rèn)無(wú)病后實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周備用；兔抗殺香魚假單胞菌多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（TCBS）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；電泳儀、紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）；離心機(jī)（Eppendorf）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)業(yè)有限公司）；恒溫?fù)u床（太倉(cāng)市科教器材廠）；顯微鏡（Nikon）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人工回感試驗(yàn)

將保存的菌株ZS161211在TSA培養(yǎng)基上劃線，18℃下培養(yǎng)24～48 h，用1.5%生理鹽水從平板上洗下菌苔，分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度，將菌液稀釋至終濃度為5×104 cfu/mL。試驗(yàn)魚每尾腹腔注射稀釋的菌液100 μL，使感染菌相對(duì)魚體重的終濃度為100 cfu/g，對(duì)照組魚腹腔注射1.5%生理鹽水100 μL。試驗(yàn)期間水溫控制在20℃，不投餌，連續(xù)充氣。注射后24 h開始取樣，取樣時(shí)對(duì)試驗(yàn)魚的肝脾腎內(nèi)臟組織分別進(jìn)行細(xì)菌分離，同時(shí)取適量組織塊使用Bouin氏液進(jìn)行固定。

1.2.2 人工感染試驗(yàn)魚病理組織切片制備

無(wú)菌取發(fā)病魚的肝、脾、腎等內(nèi)臟組織，加1.5%無(wú)菌生理鹽水剪碎，涂布TCBS培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)24～48 h觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；取試驗(yàn)魚的肝、脾、頭腎、中腎及鰓絲分別約4 mm×4 mm×5 mm，經(jīng)Bouin氏液固定，在24 h后換數(shù)次75%乙醇沖洗，最后保存于75%的乙醇中。固定的樣品經(jīng)后續(xù)不同濃度乙醇系列脫水及丙酮脫水過(guò)程后，移入二甲苯溶液中透明，經(jīng)浸蠟包埋后切片、貼片，烤干后展片以蘇木精-伊紅染色法（H&E染色）染色，樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)殺香魚假單胞菌在組織內(nèi)分布

將已制作好的石蠟切片脫蠟水化，滴加3%H2O2于載玻片上進(jìn)行內(nèi)源性酶滅活，然后將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液中，直接煮至92～98℃進(jìn)行抗原暴露，冷卻后滴加5%BSA封閉，滴加兔抗殺香魚假單胞菌抗?jié)窈蟹跤?，滴加生物素化山羊抗兔二抗?jié)窈蟹跤?，加入辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行SP反應(yīng)，滴加新鮮配制的試劑DAB顯色，清洗后蘇木素復(fù)染，最后滴加中性樹脂膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，顯微鏡下觀察拍照，顯微鏡下中呈棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原的定位，未有抗原定位的則被蘇木精染色成藍(lán)色。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀與剖解變化

試驗(yàn)組魚注射24 h后出現(xiàn)游動(dòng)緩慢，應(yīng)激反應(yīng)遲鈍等臨床癥狀；注射72 h后試驗(yàn)魚出現(xiàn)死亡，死亡魚體表無(wú)潰瘍等癥狀，主要是鰓充血。剖解病死魚，部分魚有腹水，肝充血嚴(yán)重，脾臟布滿白色小結(jié)節(jié)和腎臟白色結(jié)節(jié)較脾臟大（圖1）。無(wú)菌取病死魚的內(nèi)臟組織分別在TCBS和TSA培養(yǎng)基上接種劃線，27℃培養(yǎng)24 h，TCBS上長(zhǎng)出特征性的殺香魚假單胞菌針尖大小的綠色小菌落，TSA上為乳白色、邊緣光滑、表面濕潤(rùn)的菌落。經(jīng)藥敏試驗(yàn)和生理生化學(xué)試驗(yàn)確認(rèn)與感染菌株ZS161211一致。

臨床解剖觀察（圖2）顯示試驗(yàn)組感染魚的肝、脾、腎等內(nèi)臟組織與器官都表現(xiàn)出不同程度的充血、出血、壞死等。肝細(xì)胞發(fā)生廣泛性變性，或壞死、溶解，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性，腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、嚴(yán)重空泡變性、壞死崩解；脾臟少量含鐵血黃素的沉積，淋巴細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞和大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 病死魚臨床解剖圖Fig.1 Clinical anatomic map of P.crocea

圖2 病魚脾臟充滿白色結(jié)節(jié)Fig.2 P.crocea spleen full of the white nodulars

2.2 組織病理學(xué)變化

健康大黃魚肝組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形狀規(guī)則；感染魚肝臟組織結(jié)構(gòu)不明晰且伴隨充血，肝血竇與中央靜脈瘀血更明顯，肝血竇、中央靜脈以及一些肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)病原菌；肝細(xì)胞腫脹明顯、細(xì)胞核固縮，病變嚴(yán)重的區(qū)域失去原有形態(tài)結(jié)構(gòu)形成壞死灶，壞死灶中心區(qū)內(nèi)充滿解體后的細(xì)胞碎片（圖3）。

健康脾臟結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞完整；感染魚脾臟組織壞死嚴(yán)重，實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，在紅髓和白髓均可見散在的壞死灶，壞死灶內(nèi)大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，脾髓出血較為嚴(yán)重，有少量含鐵血黃素的沉積，壞死灶內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞界限模糊不清，崩解后呈現(xiàn)空泡化。

健康腎臟組織致密；感染魚腎臟充血，結(jié)構(gòu)紊亂；腎小管形狀不規(guī)則，上皮細(xì)胞肥大、顆粒變性且界限模糊不清晰、管腔狹窄，部分上皮細(xì)胞增生堵塞官腔；腎小球萎縮或崩解；嚴(yán)重的腎間質(zhì)組織廣泛性壞死，大量巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生玻璃樣變性，嚴(yán)重的壞死，甚至溶解、消失。

健康鰓絲組織緊密，有規(guī)律性；感染魚鰓絲排列不整齊，有的呈現(xiàn)波紋狀扭曲；鰓小片腫大，竇狀隙擴(kuò)張充血、滲出；鰓小片上皮細(xì)胞肥大、變圓，嚴(yán)重的上皮細(xì)胞崩解壞死脫落。

2.3 菌體在魚體內(nèi)的分布

陽(yáng)性信號(hào)主要分布于肝竇、巨噬細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)。肝組織強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)主要集中于肝竇和靜脈，吞噬細(xì)胞破裂后部分周邊區(qū)域、肝竇周圍少量肝細(xì)胞和竇壁細(xì)胞有明顯壞死性病變；脾組織中的陽(yáng)性信號(hào)位于脾臟間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的白髓區(qū)。這些迅速增殖的感染性病原體在器官和組織中引起明顯的病理變化。腎組織中的陽(yáng)性信號(hào)主要位于腎小管上皮細(xì)胞和腎小球淋巴細(xì)胞。由于在腎間質(zhì)中大量的細(xì)菌復(fù)制，組織發(fā)生壞死和崩解，并且也可在崩解組織中檢測(cè)到。鰓組織中的陽(yáng)性信號(hào)集中在小的上皮細(xì)胞和基底毛細(xì)血管中（圖4）。

圖3 人工回感魚組織病理變化圖，HEFig.3 Histopathological lesions on P.crocea infected by P.plecoglossicida

圖4 人工回感魚組織免疫組化圖Fig.4 Immunohistochemical staining results of P.crocea infected by P.plecoglossicida

3 討論

本研究在水溫20℃條件下，對(duì)養(yǎng)殖大黃魚進(jìn)行了殺香魚假單胞菌人工感染實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用組織病理與免疫組化技術(shù)對(duì)發(fā)病魚內(nèi)臟組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示殺香魚假單胞菌對(duì)大黃魚組織機(jī)體，尤其是內(nèi)臟組織造成了嚴(yán)重?fù)p傷。

大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病是近年來(lái)在大黃魚養(yǎng)殖中暴發(fā)流行的一種細(xì)菌性疾病，因病魚脾、肝臟、腎等內(nèi)臟長(zhǎng)滿白色結(jié)節(jié)而得名，假單胞菌屬的細(xì)菌被確認(rèn)為該病病原，目前有許多關(guān)于大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病病原的報(bào)道[7-9]。由于大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病臨床發(fā)病急、體表無(wú)明顯臨床癥狀、低水溫發(fā)病等特點(diǎn)給該病的防治造成很大困難。關(guān)于該病病原假單胞菌種的鑒定一直未能統(tǒng)一，直到2013年張杰等[6]通過(guò)全基因組測(cè)序確認(rèn)其為殺香魚假單胞菌。殺香魚假單胞菌由日本學(xué)者NISHIMORI，et al[10]從淡水養(yǎng)殖的患病香魚體內(nèi)首次分離得到并且命名。殺香魚假單胞菌不僅存在于淡水環(huán)境中，也廣泛存在于海水環(huán)境中，而且是危害較大的致病菌[4]。

本文采用殺香魚假單胞菌單位為100 cfu/g，注射至大黃魚腹腔內(nèi)，感染24 h即開始發(fā)病，肝、脾、中腎、頭腎上出現(xiàn)明顯的白色結(jié)節(jié)，與自然發(fā)病癥狀相同，且從感染魚內(nèi)臟組織中分離培養(yǎng)到了殺香魚假單胞菌。組織病理觀察結(jié)果顯示，感染魚肝、脾、腎等內(nèi)臟組織都出現(xiàn)明顯病變損傷，全身組織器官?gòu)V泛性表現(xiàn)出不同程度的充血、出血、壞死等，隨著菌體在大黃魚體內(nèi)大量增殖，最終導(dǎo)致其全身多組織細(xì)胞壞死溶解，魚因多組織器官的功能衰竭而死亡，這些組織病理變化與張丹楓等[5]對(duì)自然患病魚的組織病理觀察結(jié)果一致。

免疫組化技術(shù)利用標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原進(jìn)行定位檢測(cè)，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)的顯色反應(yīng)呈現(xiàn)醒目的陽(yáng)性色彩，因此免疫組化可清楚直觀的反映病原感染生物體后的分布狀況[11-12]。隨著現(xiàn)代魚類病害學(xué)、分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使病理形態(tài)和功能的研究更加深入，免疫組化已成為在水產(chǎn)病害學(xué)科研究中的新型手段。連林坤[13]運(yùn)用免疫組化方法開展了螺原體對(duì)中華絨螯蟹Eriocheir sinensis H.Milne-Edwards和克氏原螯蝦Procambarus clarkii不同器官和組織的感染病理學(xué)研究，證實(shí)了不同水生動(dòng)物上分離到的螺原體對(duì)不同寄主存在感染差異。本試驗(yàn)應(yīng)用免疫組化法對(duì)人工感染大黃魚各組織器官內(nèi)殺香魚假單胞菌進(jìn)行定位檢測(cè)，在試驗(yàn)組魚的肝、脾、腎和鰓絲各相關(guān)組織器官中觀察到了特征性的陽(yáng)性信號(hào)，這些陽(yáng)性信號(hào)主要分布于肝血竇、脾間質(zhì)或巨噬細(xì)胞、腎間質(zhì)活巨噬細(xì)胞以及腮絲的巨噬細(xì)胞內(nèi)，表明殺香魚假單胞菌對(duì)機(jī)體多組織、器官都具有侵染性。試驗(yàn)結(jié)果表明免疫組化能成功反映殺香魚假單胞菌感染大黃魚后在機(jī)體內(nèi)的分布情況。通過(guò)組織病理學(xué)觀察與免疫組化染色的結(jié)果相比較，魚體組織病理?yè)p傷程度與免疫組化檢測(cè)的中陽(yáng)性信號(hào)的有無(wú)與強(qiáng)弱表現(xiàn)出較高一致性，其病理?yè)p傷與病原菌分布數(shù)量呈明顯的正相關(guān)。

魚類的巨噬細(xì)胞是魚類的非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，當(dāng)病原微生物表面覆蓋有免疫球蛋白和補(bǔ)體成分時(shí)，巨噬細(xì)胞可通過(guò)這些因子的特異性受體識(shí)別并殺傷微生物[14]。但一些病原菌可以適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)的生活環(huán)境，并作為其生活史的一部分，使其自身免受其它細(xì)胞介導(dǎo)和體液免疫反應(yīng)的傷害，巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力已成為很多病原菌毒力機(jī)制的重要組成部分[15-16]。張杰等[17]通過(guò)電鏡超薄切片觀察發(fā)現(xiàn)殺香魚假單胞菌也可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和增殖，本試驗(yàn)的免疫組化結(jié)果顯示在試驗(yàn)魚的多個(gè)組織器官的巨噬細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，為以后進(jìn)一步進(jìn)行殺香魚假單胞菌對(duì)大黃魚的致病機(jī)理研究提供了更多參考資料。