絨毛膜癌是一種惡性度極高的滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤，其轉(zhuǎn)移、侵襲發(fā)生較早，是造成患者死亡的重要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞表型并具有遷移能力的過(guò)程[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究[2-3]表明，EMT在許多惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著重要角色。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在EMT過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4-5]，但關(guān)于其在絨毛膜癌EMT中的作用及機(jī)制研究較少。本研究采用Wnt 信號(hào)通路外源性阻滯劑DKK-1作用于人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞，探討Wnt 信號(hào)通路在絨毛膜癌細(xì)胞EMT及遷移、侵襲過(guò)程的作用機(jī)制，以期為臨床提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與主要試劑人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞購(gòu)自北京中科院動(dòng)物研究所計(jì)劃生育及生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，RPMI-1640 培養(yǎng)基為美國(guó) GIBCO 公司產(chǎn)品(批號(hào)為Z-SD-0018-02)，DKK-1為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品(使用前用細(xì)胞培養(yǎng)基混合粉末配制成1 000 ng/mL，-20 ℃保存)，兔抗人β-catenin抗體(批號(hào)：3170906259F)、Wnt抗體(批號(hào)：2760906248E)、Vimentin抗體(批號(hào)：170503178C)、E-cadherin抗體(批號(hào)：170712589E)均為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增試劑盒(批號(hào)：303E058)為法國(guó)Transgene公司產(chǎn)品，北京博大泰克生物技術(shù)有限公司完成引物設(shè)計(jì)、合成，Transwell小室(批號(hào)：GR166578-6)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)(批號(hào)：GR157569-4)、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF，批號(hào)：GR162467-6)購(gòu)自美國(guó)costar公司，垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、D-140圖像分析系統(tǒng)為大連競(jìng)邁儀器有限公司產(chǎn)品，常規(guī)試劑購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑公司。焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)，1.0 mL的DEPC加入1000 mL雙蒸水，過(guò)夜后備用。溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染液配制:將1.0 g的EB加入100 mL去離子水中，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，室溫避光保存。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)絨毛膜癌細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再用培養(yǎng)液將其制備成細(xì)胞濃度為5×104cells/mL的單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液4 mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待其貼壁生長(zhǎng)。采用2.5 g/L胰酶消化2～3 min后繼續(xù)培養(yǎng)，再將其制備成5×104/ mL單細(xì)胞懸液，吸取懸液接種于6孔板內(nèi)，密度為1×106/孔，每組設(shè)平行孔6 個(gè)，接種12 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)[6]。

1.2.2蛋白印跡法(Western blot法)檢測(cè)兩組細(xì)胞中不同蛋白的表達(dá)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)24 h后更換培養(yǎng)基，按完全隨機(jī)法將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組6孔，實(shí)驗(yàn)組給予100 ng/mL的DKK-120 μL(廠(chǎng)家：博士德生物工程有限公司，批號(hào):753223A)，對(duì)照組加入同體積細(xì)胞培養(yǎng)基。干預(yù)48 h 后取兩組細(xì)胞分別經(jīng)PBS漂洗、4 000 r/min離心后，加入細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min，提取總蛋白質(zhì)。蛋白上樣于10 %SDS-PAGE凝膠并電泳2.5 h，電壓80 V；常規(guī)電轉(zhuǎn)移至PVDF；將PVDF膜至于封閉液中封閉，搖床平衡1 h，每組分別加入5%牛血清白蛋白/磷酸鹽吐溫緩沖液(bovineserum albumin/phosphatebuffered salinewith tween 20，BSA/PBST)緩沖液(1∶1 000)稀釋的兔抗人β-catenin 20 μL、Snail抗體20 μL、Vimentin抗體20 μL、E-cadherin抗體20 μL，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST充分漂洗，加入用5%的脫脂牛奶/PBST緩沖液稀釋1 000倍的二抗20 μL，室溫孵育2h；取出PVDF膜用PBST充分漂洗3次；顯影曝光采用ECL電發(fā)光試劑盒。用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描各目標(biāo)條帶，記錄其分子量及灰度值，待測(cè)蛋白的表達(dá)量=各目標(biāo)條帶與內(nèi)參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的灰度值之比[7]。

1.2.3RT-PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中不同基因的表達(dá)所有引物均由北京賽百勝生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列詳見(jiàn)表1。

表1RT-PCR引物序列

引物名稱(chēng)上游(5’-3’)下游(5’-3’)引物大小(bp)退火溫度(℃)β-cateninGGCACCTCTGTGAACATGCTAATCTTGTGGCTTGTCGTCA52154WntTCGCACAGCGCATCATCTATTCCGACTAGCTACCAATACC20555E-cadherinGGTCTCTCTCAGCACCTCCACCTCGGACACTACCACTCTC26350VimentinAGAGAACATAGCGGTTGTAGCACGTAGGTGTCGACGCAAT19556GAPDHTGGCTAGAGCAACACGGTGATCGCAACTGAGACGAGGG17654

干預(yù)48 h 后取出兩組細(xì)胞，將培養(yǎng)板中培養(yǎng)基吸出棄去，用PBS液充分洗滌3次。分別提取各組細(xì)胞總RNA，然后檢測(cè)其完整性、濃度和純度，如RNA合格則將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄為模版DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總 RNA 5～500 ng，T重復(fù)寡核苷酸(0.5 μg/μL)1 μL，酶系統(tǒng)反應(yīng)混合物10 μL，即刻反應(yīng)酶混合物1 μL，補(bǔ)DEPC水至20 μL。取2 μL用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：模版 DNA 2 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，1 mol/L Mg2+5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷酸4 μL，DNA 聚合酶 0.5 μL，補(bǔ)雙蒸水至50 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，循環(huán)1次；95 ℃變性15 s，60℃退火30 s(引物不同退火溫度也不同)，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次[8]；72 ℃總延伸6 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物與緩沖液混合，然后加入2 %瓊脂糖凝膠的加樣孔中開(kāi)始電泳，每孔5 μL，電壓4～10 V，電泳后EB染色，在紫外線(xiàn)投射儀下觀察電泳條帶。數(shù)據(jù)記錄及分析運(yùn)用D-140圖像分析系統(tǒng)處理，目的基因表達(dá)量=目的基因的DNA條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH 的DNA條帶灰度值。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察兩組細(xì)胞的遷移能力接種細(xì)胞前用記號(hào)筆在6孔板底部畫(huà)間隔均勻的網(wǎng)格線(xiàn)，以便觀察細(xì)胞遷移情況。細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)24 h后更換培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組給予100 ng/mL的DKK-1 20 μL，對(duì)照組加入同體積細(xì)胞培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后用無(wú)菌槍頭沿著6孔板正中畫(huà)1條劃痕，仔細(xì)刮去劃痕線(xiàn)右側(cè)所有的細(xì)胞，標(biāo)記好劃痕線(xiàn)。PBS 液充分漂洗以去除漂浮的腫瘤細(xì)胞，劃痕后繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后即刻、12、24及48小時(shí)時(shí)在400倍倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。計(jì)數(shù)方法：沿劃痕線(xiàn)從上至下觀察 5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每視野下越過(guò)劃痕線(xiàn)的細(xì)胞數(shù)量，每培養(yǎng)孔遷移細(xì)胞數(shù)量=5個(gè)視野越過(guò)劃痕線(xiàn)的細(xì)胞數(shù)量之和。

1.2.5Transwell小室檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲能力兩組腫瘤細(xì)胞在0.2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)無(wú)血清培養(yǎng)基孵育(實(shí)驗(yàn)組加DKK-1，100 ng/mL 20 μL)過(guò)夜。Transwell小室置入 24 孔板，將基質(zhì)膠用 0.2% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶5稀釋后，吸取50 μL加入Transwell小室上室，37℃溫箱過(guò)夜使稀釋后的基質(zhì)膠凝固。使用前再在小室上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，下室加入小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3的培養(yǎng)基600 μL[4]，水化 30 min。制備細(xì)胞懸液，懸液濃主調(diào)整為5×105cells/mL，取200 μL懸液加入Transwell上室后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，然后將細(xì)胞鋪片于濾膜上，蘇木素染色，400倍顯微鏡觀察。每張鋪片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每張鋪片侵襲細(xì)胞數(shù)=5個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)之和/5。

2　結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞各蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞中β-catenin、Wnt、Vimentin蛋白平均表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表2。

圖1　Western Blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中各蛋白表達(dá)水平

2.2兩組細(xì)胞各基因表達(dá)情況比較與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞中β-catenin、Wnt、Vimentin mRNA表達(dá)水平均降低，E-cadherin mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表2　兩組絨毛膜癌細(xì)胞中各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

表3　兩組絨毛膜癌細(xì)胞中各基因 mRNA的表達(dá)

2.3兩組細(xì)胞遷移能力比較隨著時(shí)間的延續(xù)，兩組腫瘤細(xì)胞越過(guò)劃痕線(xiàn)的數(shù)目逐漸增高；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組劃痕后12、24及48小時(shí)越過(guò)劃痕線(xiàn)的細(xì)胞數(shù)目均減少，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表4。

表4　兩組絨毛膜癌在不同時(shí)間內(nèi)遷移細(xì)胞數(shù)目比較

圖2兩組絨毛膜癌細(xì)胞遷移情況(×400)

注：A為實(shí)驗(yàn)組劃痕后0即刻；B為對(duì)照組劃痕后即刻；C為實(shí)驗(yàn)組劃痕后48小時(shí)；D為對(duì)照組劃痕后48小時(shí)

2.4兩組細(xì)胞侵襲能力比較實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為(33.71±2.21)個(gè)，低于對(duì)照組的(78.21±4.14)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5　兩組絨毛膜癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)目比較

3　討論

絨毛膜癌是滋養(yǎng)層細(xì)胞惡性腫瘤，生長(zhǎng)迅速，轉(zhuǎn)移早，雖然化療可使近90%的絨毛膜癌患者病情得到控制，但部分患者仍會(huì)發(fā)生無(wú)控性的侵襲與轉(zhuǎn)移，這也導(dǎo)致患者病情惡化或死亡。因而，如何抑制絨毛膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移成為婦科臨床重要研究課題。

EMT是上皮細(xì)胞通過(guò)骨架重塑，在形態(tài)學(xué)上向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，上皮性標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量較成熟上皮表達(dá)減少，間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin 表達(dá)量較成熟上皮表達(dá)增多。王麗等[9]通過(guò)轉(zhuǎn)染GV144-SCUBE2質(zhì)粒使 HCT116細(xì)胞過(guò)表達(dá)SCUBE，采用RT-PCR、Western blot法檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin等的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt /β-catenin信號(hào)通路后，可阻斷結(jié)腸癌細(xì)胞EMT發(fā)生。李琳等[10]用熊果酸體外培養(yǎng)腎臟足細(xì)胞，采用免疫熒光、Western blot、RT-PCR法檢測(cè)Wnt /β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因、EMT部分標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)熊果酸可通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt /β-catenin信號(hào)通路抑制足細(xì)胞EMT。上述研究表明，EMT過(guò)程中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路(Wnt /β-catenin信號(hào)通路)起著重要作用。

本研究用Wnt 信號(hào)通路外源性阻滯劑DKK-1干擾人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞，采用Western blot、RT-PCR分別檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中Wnt、β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白及mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，阻斷Wnt 信號(hào)通路后，通路關(guān)鍵基因Wnt、β-catenin蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組表達(dá)水平(P<0.05)，同時(shí)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin顯著降低、上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin顯著升高(P<0.05)。提愛(ài)軍等[11]通過(guò)抑制人膽管癌細(xì)胞株QBC939Wnt信號(hào)通路后，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)升高而間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin表達(dá)減少，陳海滔等[12]用姜黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)也得到與本研究類(lèi)似的結(jié)果。這些都提示，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞的EMT過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

本研究在阻斷Wnt 信號(hào)通路后，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)兩種腫瘤細(xì)胞越線(xiàn)數(shù)目及穿膜數(shù)目，以比較兩組腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力改變。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組劃痕后12、24及48 h越過(guò)劃痕線(xiàn)的細(xì)胞數(shù)目均低于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組(P<0.05)。提示阻斷Wnt 信號(hào)通路能降低人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞的遷移與侵襲能力。

結(jié)合Wnt 信號(hào)通路及EMT標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果，阻斷Wnt 信號(hào)通路可能抑制了人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞EMT，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲能力降低。DKK-1作用于Wnt 信號(hào)通路后，β-catenin降解增加，在腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)逐漸堆積減少[13]，并影響通路β-catenin、Snail等基因的轉(zhuǎn)錄，從而使得間質(zhì)樣表型Vimentin表達(dá)減弱、上皮樣表型E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)上皮細(xì)胞樣的極性，細(xì)胞間的橋粒、細(xì)胞間橋、緊密連接等增多，侵襲、遷移能力自然降低。

綜上所述，阻斷Wnt 信號(hào)通路后，人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞EMT受抑，進(jìn)而出現(xiàn)遷移與侵襲能力降低，但EMT過(guò)程受抑的具體作用位點(diǎn)、腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲能力降低的具體機(jī)制等問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。

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