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        Vero細(xì)胞培養(yǎng)A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va流感病毒適宜條件研究

        2018-04-10 08:39:28非成瑞馬磊高菁霞崔兆海宋紹輝李衛(wèi)東廖國陽
        生物技術(shù)通訊 2018年6期
        關(guān)鍵詞:胰酶血凝滴度

        非成瑞,馬磊,高菁霞,崔兆海,宋紹輝,李衛(wèi)東,廖國陽

        中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南 昆明650118

        流感病毒目前仍是人類健康的重大威脅之一[1-3]。H7N9 流感病毒自2013年以來,在我國共計發(fā)生5 次人群感染暴發(fā)疫情,截至2017年8月7日,感染病例1557 例,其中605 人死亡,病死率高達(dá)38.86%[3]。疫苗接種是對抗流感病毒感染和傳播的最有效方法。20 世紀(jì)40年代以來,雞胚生產(chǎn)人用流感疫苗的方法已成功使用了數(shù)十年[4-5]。然而,當(dāng)面臨流感大流行或生產(chǎn)針對高致病性甲型流感病毒的疫苗時,雞胚的生產(chǎn)能力有限,并且卵清蛋白的存在會引起過敏反應(yīng)[6]。相比之下,基于細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)系統(tǒng)可以更快速地生產(chǎn)疫苗,更容易擴(kuò)大規(guī)模,不會引起過敏反應(yīng),并且有研究表明與MDCK 細(xì)胞和雞胚相比,在Vero 細(xì)胞中培養(yǎng)的甲型流感病毒血凝素蛋白(hemagglu?tinin,HA)糖基化方式與在人呼吸道上皮細(xì)胞分離出的流感病毒更接近,用Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗可能能更好地介導(dǎo)人體產(chǎn)生對流感的免疫應(yīng)答[7],該細(xì)胞系的安全性已得到充分證實(shí)[8],世衛(wèi)組織建議將Vero 細(xì)胞作為流感疫苗生產(chǎn)的替代基質(zhì),這也是流感大流行應(yīng)急儲備的一項重要內(nèi)容。在本研究中,我們用Vero 細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì),培養(yǎng)反向遺傳學(xué)技術(shù)重組獲得的H7N9 病毒株,對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后連續(xù)傳代15 代得到Vero 細(xì)胞適應(yīng)的H7N9 高產(chǎn)株,并對細(xì)胞工廠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)條件優(yōu)化,病毒產(chǎn)量穩(wěn)定,可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        143 代Vero 細(xì)胞來源于美國ATCC;甲型流感病毒Vero 細(xì)胞適應(yīng)株A/Shanghai/02/2013(H7N9)Va,是由H3N2 流感病毒Vero 細(xì)胞適應(yīng)株的6 個基因片段(PB1、PB2、PA、NP、M、NS)與H7N9 的2 個基因片段(HA、NA)重配獲得,該重配毒株的減毒特性已在動物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[9]。細(xì)胞和毒株均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品五室保存。

        DMEM/F12 培養(yǎng)基購自Gibco 公司;MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和PBS 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所溶液組提供;TPCK 胰酶購自Worthington 公司;牛血清白蛋白(BSA)購自北京索萊寶科技有限公司;細(xì)胞工廠購自賽默飛世爾科技有限公司;流感病毒吸附液(DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合,添加不同量的碳酸氫鈉和TPCK 胰蛋白酶)、維持液[DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合,添加0.3 mg/mL BSA、1%谷氨酰胺和0.5%雙抗(10 kU/mL 青霉素+10 mg/mL 鏈霉素)為基本成分,添加不同量的碳酸氫鈉和TPCK 胰蛋白酶等]由云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

        1.2 病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化

        采用單一變量法,分別對病毒接種MOI、培養(yǎng)溫度、pH 值和TPCK 胰酶等毒株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。向基本成分中加入不同濃度的TPCK 胰酶,分別配制病毒吸附液和維持液。T225 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長成致密單層的Vero 細(xì)胞經(jīng)0.125%的胰蛋白酶消化后傳代至T25 瓶中,置37℃培養(yǎng)48 h;細(xì)胞長滿致密單層后用PBS 洗3 次,因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)液中血清類淀粉蛋白P 會抑制甲型流感病毒表面唾液酰化糖蛋白的活性,影響病毒的產(chǎn)量[10],根據(jù)不同條件接種H7N9 型重配流感病毒,置37℃培養(yǎng)吸附1 h;加入病毒維持液后于33℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后收集培養(yǎng)液,3000r/min 離心20 min,收集上清液,測定血凝滴度[11]。

        1.3 病毒在Vero細(xì)胞中的連續(xù)傳代培養(yǎng)

        Vero細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后,H7N9病毒用吸附液(DMEM/F12和MEM以1∶1混合,添加1.5μg/mLTPCK胰蛋白酶和NaHCO3至pH值為7.4)以1∶1000稀釋后接種Vero細(xì)胞,于34℃吸附1h后補(bǔ)加維持液(DMEM/F12和MEM以1∶1混合,添加0.3mg/mLBSA、1%谷氨酰胺、0.5%雙抗和1.5μg/mL TPCK胰蛋白酶,添加NaHCO3至pH值為7.4),于34℃繼續(xù)培養(yǎng),感染48h后補(bǔ)加TPCK胰酶至1μg/mL,72h后收集培養(yǎng)上清,3000r/min離心20min,收集上清液,測定血凝滴度,凍存于-80℃。所收獲的病毒液以1∶1000稀釋后繼續(xù)接種對數(shù)生長期的Vero細(xì)胞。如此連續(xù)傳代至第15代。

        1.4 測定病毒TCID50

        將MDCK 細(xì)胞用0.125%胰酶消化后計數(shù),以1.5×104/孔的數(shù)量加到96 孔板中,于37℃、0.5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h 后細(xì)胞長滿致密單層,用病毒稀釋液(DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合,添加0.3 mg/mL BSA、1%谷氨酰胺、0.5%雙抗和2 μg/mL TPCK 胰酶,并添加NaHCO3至pH 值為7.2~7.6)將病毒進(jìn)行1/10 梯度稀釋,每個稀釋度8 個孔,每孔100 μL 病毒稀釋液,于34℃、0.5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,收獲病毒感染細(xì)胞上清液,測定血凝效價,按Reed-Meunch 法計算病毒感染性滴度(TCID50/mL)。

        1.5 細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)及工作種子批的制備

        按照優(yōu)化的H7N9 流感病毒培養(yǎng)條件,用細(xì)胞工廠培養(yǎng)病毒。細(xì)胞工廠規(guī)格為10 層托盤,培養(yǎng)面積6320 cm2,培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量最高可達(dá)16 億,一個細(xì)胞工廠的病毒液產(chǎn)量為1.5 L。但是,利用細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)病毒時,病毒吸附這一步驟使生產(chǎn)工藝變得繁瑣。為簡化Vero 細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)流感病毒的工序,通過實(shí)驗(yàn)對比吸附和不吸附接種病毒,檢測病毒收獲液的血凝效價,同時接種20 個細(xì)胞工廠,其中10 個用以MOI 為0.001 稀釋后吸附1 h 再補(bǔ)加維持液接種病毒,其余則將病毒按MOI 為0.001 直接用維持液稀釋接種Vero 細(xì)胞。同時為制備工作種子批,接種18 個細(xì)胞工廠,收獲病毒液,6000 r/min 離心15 min 去除細(xì)胞碎片,以13 mL/支分裝,凍存于-80℃。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

        所有實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)采用Graphpad軟件分析,以x±s表示各指標(biāo)水平,組間差異性檢驗(yàn)采用方差分析(Ordinary one-way ANOVA),P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 病毒培養(yǎng)條件

        在其他條件保持一致情況下,分別以MOI 為0.001、0.01、0.1、1.0 接種病毒,血凝效價統(tǒng)計學(xué)結(jié)果無顯著性差異(圖1A),雖然MOI 為1 和0.1 時細(xì)胞在50~60 h 全部病變,MOI 為0.01 和0.001 則需要66~72 h,但是在建立毒種時要求毒種能以最小接種量達(dá)到最大產(chǎn)量,且大規(guī)模生產(chǎn)疫苗時需要在快速生產(chǎn)疫苗的同時節(jié)約成本,因此最終確定最佳接種MOI 為0.001。分別在33℃、33.5℃、34℃、34.5℃和35℃下培養(yǎng)H7N9 流感病毒,34℃、34.5℃和35℃的結(jié)果顯示無顯著性差異,均可達(dá)到較高的血凝滴度(圖1B)。分別以pH 值為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8 和8.0 培養(yǎng)H7N9 病毒,最終得到最佳培養(yǎng)pH 值為7.4(圖1C)。由于流感病毒增殖過程中需要TPCK 胰酶使血凝素前體蛋白(hae?magluttinin precursor,HA0)裂解為HA1 和HA2 后才具有感染性,在吸附液和維持液中須添加一定量的TPCK 胰酶,并且為了保障新的病毒可以繼續(xù)復(fù)制,需要在病毒培養(yǎng)一段時間后進(jìn)行補(bǔ)加,但實(shí)驗(yàn)證明過多的TPCK 胰酶會對細(xì)胞造成損傷,反而會影響病毒的復(fù)制。設(shè)置TPCK 胰酶添加量分別為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 μg/mL,并且在48 h 后補(bǔ)加量為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL,最終得到的TPCK 胰酶添加量和病毒培養(yǎng)48 h 后的補(bǔ)加量分別為1.5 μg/mL(圖1D)和1.0 μg/mL(圖1E)。

        綜上所述,該重配H7N9 流感病毒的最適培養(yǎng)條件為:以MOI 為0.001 接種病毒,培養(yǎng)液pH 值為7.4,TPCK 胰酶添加量為1.5 μg/mL 時,于34~35℃培養(yǎng)48 h,補(bǔ)加TPCK 胰酶至終濃度為1.0 μg/mL,培養(yǎng)72 h 左右,待細(xì)胞完全病變時收獲培養(yǎng)液。

        2.2 病毒連續(xù)傳代結(jié)果

        用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件接種病毒,病毒收獲后以1∶1000 稀釋,連續(xù)傳至15 代,檢測每一代的血凝效價和病毒感染性滴度。結(jié)果表明,病毒的血凝效價和TCID50隨著傳代代次逐漸提高,血凝效價最高可達(dá)512,TCID50最高可達(dá)到108.5/mL,并保持相對穩(wěn)定(圖1F)。且病毒感染Vero 細(xì)胞后,72 h 內(nèi)不同時間段均可明顯觀察到不同程度的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),直到所有細(xì)胞病變脫落(圖2)。

        2.3 細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)及工作種子批的制備

        按照優(yōu)化條件分別對比吸附和不吸附條件,各接種10 個細(xì)胞工廠后,收獲病毒液檢測每一個細(xì)胞工廠血凝效價,結(jié)果顯示病毒不吸附接種可以達(dá)到和吸附接種相同的血凝效價和感染性滴度。證明大規(guī)模培養(yǎng)時可以簡化病毒培養(yǎng)工序而不影響病毒產(chǎn)量。同時,利用該培養(yǎng)系統(tǒng)成功建立了毒種工作種子批,13 mL/支分裝量,一支可接種100 個細(xì)胞工廠。結(jié)果見表1。

        圖1 不同培養(yǎng)條件下血凝效價結(jié)果及連續(xù)傳代結(jié)果

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了經(jīng)反向遺傳學(xué)重配獲得的H7N9 型流感毒株在Vero 細(xì)胞中的培養(yǎng)條件。Vero 細(xì)胞生長至對數(shù)期時,細(xì)胞致密且狀態(tài)較好,培養(yǎng)流感病毒后血凝效價最高;而胞齡過大時細(xì)胞對流感病毒不敏感,不能引起病毒的有效感染。病毒接種MOI 主要與毒種和病毒感染性滴度有關(guān),若TCID50較低,可能MOI 為0.1 以上才能達(dá)到較高的血凝效價[11-12],而本實(shí)驗(yàn)毒株在MOI 分別為1、0.1、0.01 和0.001 時均可達(dá)到相同血凝效價,只是病變時間不同。細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒時,只有添加TPCK 胰酶使HA0 裂解為HA1 和HA2 后病毒才具有感染性,有研究表明培養(yǎng)流感病毒H5N1 時TPCK 胰酶添加量為5 μg/mL[12],但是本研究證明過多的TPCK 胰酶會對Vero 細(xì)胞造成損傷,導(dǎo)致病毒沒有足夠的宿主細(xì)胞來復(fù)制,并通過實(shí)驗(yàn)得到TPCK 胰酶添加量應(yīng)為1.5 μg/mL;TPCK 胰酶隨著病毒復(fù)制會被不斷消耗,為了滿足病毒新一輪的復(fù)制,培養(yǎng)48 h 后應(yīng)補(bǔ)加TPCK 胰酶至1.0 μg/mL,此時部分細(xì)胞已病變脫落,補(bǔ)加TPCK 胰酶過多會對細(xì)胞造成更大損傷。連續(xù)傳代15 代后,病毒產(chǎn)量提高,血凝效價可達(dá)512,病毒感染性滴度TCID50最高可達(dá)108.5/mL,并維持穩(wěn)定。擴(kuò)大至細(xì)胞工廠培養(yǎng)可行并且對比吸附接種和不吸附接種無顯著性差異,大大簡化了細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)工藝,同時證明該毒株可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng),且產(chǎn)量穩(wěn)定,此外,利用該培養(yǎng)系統(tǒng)建立了工作種子批毒種。

        綜上所述,我們確定了用Vero 細(xì)胞培養(yǎng)H7N9 流感病毒的條件,獲得高產(chǎn)H7N9 流感病毒的Vero 細(xì)胞,并且可以利用該培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn),成功建立了工作種子批。

        圖2 高產(chǎn)毒株的細(xì)胞病變效應(yīng)

        表1 不同接種方式的血凝效價和感染性滴度

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